Resumen de Estudio funcional de mutaciones en TRF1 y POT1 y su impacto en la biología del telómero y tumorogénesis

Raúl Sánchez Vázquez

• español

  TRF1 y POT1 son dos de las proteínas integrantes de la shelterina, un complejo esencial para la protección y mantenimiento de los telómeros. En este trabajo hemos estudiado el papel de estas dos shelterinas en el desarrollo tumoral. En una primera parte se estudia la regulación post-traduccional de TRF1 humano por la vía PI3K/AKT in vivo. Para ello, se generaron mediante CRISPR-Cas9 líneas celulares humanas knock-in portadoras de alelos mutantes de TRF1 en los que los aminoácidos potencialmente fosforilables por AKT fueron sustituidos por alanina. Las células portadoras de alelos nofosforilables de TRF1 muestran una disminución en la unión de TRF1 a los telómeros y un aumento de daño global y telomérico del DNA, así como un acortamiento telomérico acelerado. Demostramos por tanto que la ruta de PI3K/AKT regula el mantenimiento de los telómeros in vivo. De hecho, señales extracelulares proliferativas inductoras de la ruta PI3K/AKT inducen alteraciones en los niveles de TRF1 y esta respuesta esta alterada en los mutantes no fosforilables de TRF1. Estos hallazgos indican que la protección y la longitud de los telómeros pueden regularse mediante señales extracelulares tales como factores de crecimiento, nutrientes o reguladores inmunitarios. El potencial tumorogénico de las líneas celulares portadoras de las variantes no fosforilables de TRF1 se ve altamente inhibido, apoyando a la inhibición de TRF1 como una estrategia prometedora para el desarrollo de terapias anti-cáncer. En la segunda parte de esta tesis y con objeto de abordar los mecanismos moleculares que subyacen a los efectos tumorogénicos de variantes mutantes POT1 en humanos, hemos generado un modelo de ratón knock-in portador de la mutación R117C que se asocia con síndrome familiar Li-Fraumeni-like con de angiosarcomas cardiacos (CAS). Tanto los fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) como los tejidos de ratones Pot1a+/ki muestran telómeros más largos que los controles wild-type. El alargamiento telomérico asociado a POT1a pR117C dependen de la actividad de la telomerasa ya que no se observa en células Tert-/-;Pot1a+/ki. Mediante el uso de ensayos de complementación, mostramos además que POT1a pR117C ejerce efectos negativos dominantes en los telómeros. Al igual que en los pacientes humanos, los ratones heterocigotos Pot1a+/ki tienen una alta incidencia de angiosarcomas, incluidos CAS, y esto se asocia a la presencia de telómeros anormalmente largos en las células endoteliales y tumores. El modelo de ratón Pot1a+/R117C constituye una herramienta útil para comprender los cánceres humanos iniciados por mutaciones POT1

• English

  TRF1 and POT1 are two of the proteins that make up shelterin, an essential complex for the protection and maintenance of telomeres. In this work we have studied the role of these two shelterins in tumor development. In the first part, the post-translational regulation of human TRF1 by the PI3K/AKT pathway in vivo is studied. To do this, knock-in human cell lines carrying TRF1 mutant alleles were generated using CRISPR-Cas9 in which the amino acids potentially phosphorylatable by AKT were replaced by alanine. Cells carrying non-phosphorylatable TRF1 alleles show decreased TRF1 binding to telomeres and increased global and telomeric DNA damage, as well as accelerated telomeric shortening. We therefore demonstrate that the PI3K/AKT pathway regulates telomere maintenance in vivo. In fact, proliferative extracellular signals that induce the PI3K/AKT pathway induce alterations in TRF1 levels, and this response is altered in non-phosphorylatable TRF1 mutants. These findings indicate that telomere length and protection may be regulated by extracellular signals such as growth factors, nutrients, or immune regulators. The tumorigenic potential of cell lines carrying non-phosphorylatable TRF1 variants is highly inhibited, supporting TRF1 inhibition as a promising strategy for the development of anti-cancer therapies. In the second part of this thesis, and in order to address the molecular mechanisms underlying the tumorigenic effects of POT1 mutant variants in humans, we have generated a knock-in mouse model carrying the R117C mutation that is associated with familial Li-syndrome. Fraumeni-like with cardiac angiosarcomas (CAS). Both mouse embryonic fibroblasts (MEF) and tissues from Pot1a+/ki mice show longer telomeres than wild-type controls. POT1a-associated telomere elongation pR117C depends on telomerase activity as it is not observed in Tert-/-;Pot1a+/ki cells. Using complementation assays, we further show that POT1a pR117C exerts dominant negative effects on telomeres. As in human patients, heterozygous Pot1a+/ki mice have a high incidence of angiosarcomas, including CAS, and this is associated with the presence of abnormally long telomeres in endothelial cells and tumors. The Pot1a+/R117C mouse model is a useful tool for understanding human cancers initiated by POT1 mutations