Resumen de Epidemiology and ecology of aphid transmitted viruses in cucurbit crops in Spain

María del Pilar Rabadán Manzanera

• español

  Resumen de la tesis:

  Los virus de plantas son responsables de enfermedades que pueden reducir tanto la calidad como el rendimiento de los cultivos. Entre ellos se encuentran los virus transmitidos por insectos vectores, cuyas enfermedades pueden volverse epidémicas, representando una amenaza para la sostenibilidad de los cultivos. Además, recientemente se esta poniendo de manifiesto la importancia de las infecciones mixtas en la epidemiología, ecología y evolución de las enfermedades virales que, junto a diversos factores abióticos como la agricultura intensiva, la pérdida de diversidad y el cambio climático, entre otros, dificulta el desarrollo y la eficacia de las medidas de control. Por lo tanto, resulta necesario llevar a cabo estudios epidemiológicos que integren análisis moleculares de las poblaciones virales para comprender cómo emergen y prevalecen las enfermedades, además de identificar qué factores modulan las dinámicas evolutivas de estas enfermedades virales en los cultivos.

  En este contexto, el objetivo principal de esta tesis ha sido estudiar la distribución de los virus transmitidos por pulgón en cultivos de cucurbitáceas en España a través de la monitorización de diferentes explotaciones agrícolas en las regiones de Murcia, Alicante y Castilla-La Mancha, incluyendo el análisis de la diversidad genética y la estructura poblacional de los principales virus, y el efecto de las infecciones mixtas en la epidemiología de las enfermedades.

  Para ello, en primer lugar, se estudió la distribución de los principales virus transmitidos por pulgón en muestras sintomáticas con amarilleos y mosaicos de dos cultivos de cucurbitáceas (melón y calabacín) de tres zonas productoras de España (Región de Murcia, Alicante y Castilla La-Mancha) durante 10 años consecutivos (2011-2020). Los principales virus detectados fueron el virus del amarilleo transmitido por pulgones de las cucurbitáceas (CABYV) y el virus del mosaico de la sandía (WMV). Otros virus, como el virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV), el virus del mosaico del pepino (CMV), el virus del mosaico marroquí de la sandía (MWMV) y el virus de la mancha anular de la papaya (PRSV) también fueron detectados, pero en menor frecuencia y principalmente en infecciones mixtas. Además, la detección de CABYV y WMV en la misma muestra fue la combinación viral más observada en todos los cultivos, zonas productoras y campañas. Los análisis estadísticos mostraron una significativa entre CABYV y WMV, sugiriendo que las infecciones mixtas podrían estar influyendo en la epidemiología evolutiva de estas enfermedades virales. Así pues, se llevó a cabo la caracterización genética de 24 aislados de CABYV y 22 aislados de WMV mediante la secuenciación de los genomas completos a través de la tecnología de alto rendimiento de molécula única en tiempo real (SMRT, PacBio). El análisis de la población de WMV mostró que la mayoría de los aislados se agrupaban en el clado Emergente sin diferenciación genética entre ellos y con una reducida variabilidad genética. Asimismo, el análisis de CABYV reveló que la mayoría de los aislados de CABYV se agruparon en el clado Mediterráneo, sin aparente diferenciación genética entre las poblaciones por zona productora o cultivo. Sin embargo, un análisis de la varianza molecular (AMOVA) mostró una estructura temporal, cuya diferenciación estaba en parte explicada por la variación molecular entre los aislados que procedían de muestras con infección simple y mixta. Estos resultados resaltan la importancia de conocer la epidemiología molecular de los virus transmitidos por pulgón en estos cultivos, así como el papel de las infecciones mixtas en la estructura poblacional de CABYV.

  En segundo lugar, se estudió la distribución de virus transmitidos por pulgón en otros dos cultivos de cucurbitáceas (sandía y calabaza) que presentaron síntomas de amarilleos durante las campañas de 2018 a 2020 en las mismas áreas productoras de España (Murcia, Alicante y Castilla-La Mancha). De nuevo, se confirmaba que CABYV era el virus con mayor prevalencia en ambos cultivos.

  Asimismo, excepto en cultivos de calabaza de Castilla-La Mancha y Alicante, WMV también se encontró con una elevada frecuencia en ambos cultivos en Murcia.

  Además, durante las prospecciones en cultivos de sandía en 2018 se observaron unos amarilleos acentuados que fueron recurrentes durante 2019 y que podían estar asociados a virus. Nuestros análisis identificaron que estos amarilleos eran causados por una nueva variante de CABYV, la cual fue caracterizada genética y fenotípicamente mediante la construcción molecular de dos clones infectivos de CABYV (CABYV-LP63 y CABYV-MEC12). Además de cumplir los postulados de Koch, los análisis comparativos mostraron que el aislado CABYV-LP63 procedente de la nueva variante presentaba una mayor carga viral en las cinco especies de cucurbitáceas testadas (melón, sandía, calabaza, calabacín y pepino). En conjunto, estos resultados sugieren la presencia de una nueva variante de CABYV afectando al cultivo de sandía y con potencial de distribuirse en el resto de los cultivos de cucurbitáceas.

  En tercer lugar, se examinó la distribución de virus que producen síntomas de mosaico en los mismos cultivos de sandía y calabaza durante las mismas campañas (2018-2020) y mismas zonas productoras (Murcia, Alicante y Castilla-La Mancha).

  Nuestro estudio reveló que WMV se encontró principalmente (53%) en ambos cultivos, con una inadvertida presencia de MWMV. Así mismo, se estudió la influencia de las infecciones mixtas en la dinámica viral de WMV y MWMV mediante la construcción de los clones infectivos de WMV (WMV-MeWMV7) y MWMV (MWMV-ZuM10). Nuestros análisis mostraron que la carga viral de cada virus varió significativamente respecto a la especie vegetal infectada y al tipo de infección (simple o mixta). Sin embargo, WMV mostró una ventaja competitiva en comparación con MWMV. Estos resultados sugerían que la escasa presencia de MWMV en los cultivos de cucurbitáceas podía ser consecuencia de la elevada distribución de WMV en las especies de plantas cultivadas.

  En cuarto lugar, con la colección de secuencias nucleotídicas de CABYV y WMV, se estudió la filodinámica de las poblaciones de aislados a nivel global a través de secuencias de proteína de la cubierta (CP) y del genoma completo (GC) con la plataforma Nextstrain. Por un lado, el análisis confirmó que los aislados de CABYV se agrupan en tres clados (asiático, mediterráneo y recombinante), y sugerían que la epidemia de CABYV probablemente se originó en el siglo XIV en el sudeste asiático, emergiendo la población mediterránea en España en el siglo XVII.

  Además, la población de CABYV muestra una gran divergencia entre los aislados asiáticos y mediterráneos, con una baja diversidad genética dentro de estas poblaciones. El análisis jerárquico de la varianza reveló una diferenciación significativa entre las poblaciones de CABYV agrupadas por localización geográfica y dentro del huésped. Por otro lado, en el caso de WMV, la reconstrucción filogenética global de la población viral confirmó que los aislados están agrupados en dos grupos, clásico y emergente. El análisis de Nextstrain sugirió que las epidemias de WMV se originaron probablemente en EEUU en el siglo XVI, mientras que en el siglo XVIII divergió la población clásica inicial y en el siglo XIX la población emergente. El análisis confirma que la población de WMV tiene un origen polifilético, con una extensa diversidad genética. En este sentido, este trabajo pone en manifiesto la relevancia de entender la dinámica evolutiva de los patógenos a escala global, siendo fundamental para el desarrollo de estrategias de control efectivas y duraderas.

  Por último, se estudió cómo las infecciones simples y mixtas de CABYV y WMV podían afectar la acumulación de cada virus en plantas de melón y calabacín bajo diferentes condiciones de temperatura (20, 26 y 32ºC). Para ello se utilizo el clon infectivo de CABYV (CABYV-LP63) e inoculaciones de plantas con pulgones ápteros de Aphis gossypii.

  Mientras que para la inoculación de WMV se utilizo el clon infectivo WMV-MeWM7 y las inoculaciones se realizaron de forma mecánica. En infecciones mixtas, nuestros análisis mostraron que la carga viral de CABYV aumentó en presencia de WMV en melón y en calabacín, produciéndose una interacción inversa respecto a las infecciones simples.

  Además, observamos una asociación significativa entre temperatura y acumulación de virus, con un incremento de acumulación de CABYV a 26ºC en ambas plantas. Por el contrario, la temperatura no tuvo efecto sobre la carga viral de WMV, aunque su acumulación fue reducida bajo las tres condiciones de temperatura en melón, mientras que en calabacín WMV tuvo una carga viral similar en infección simple y mixta. Este trabajo destaca la relevancia que tiene la combinación de factores bióticos y abióticos para entender la ecología y dinámica poblacional de virus a la hora de desarrollar métodos de control que sean eficaces y duraderos frente a las enfermedades de virus de plantas.

  En general, los resultados obtenidos en esta tesis resaltan la importancia de estudiar la epidemiología molecular de los virus afectando a cultivos, así como la relevancia de entender la dinámica evolutiva de los virus a nivel regional y global, además, de manifestar el impacto que pueden tener las infecciones mixtas y las condiciones ambientales en la ecología y evolución de las enfermedades virales.

• English

  This doctoral dissertation has been presented in the form of thesis by publication. Plant viruses are responsible for diseases that can reduce both crop quality and yield. Among them are insect vector-transmitted viruses, whose diseases can become epidemic, threatening the sustainability of crops. Additionally, the importance of mixed infections in the epidemiology, ecology, and evolution of viral diseases is being increasingly recognized, along with various abiotic factors such as intensive agriculture, loss of diversity, and climate change, among others, which hinder the development and effectiveness of control measures. Therefore, it is necessary to carry out epidemiological studies that integrate molecular analyses of populations to understand how diseases emerge and prevail, as well as to identify which factors modulate the evolutionary dynamics of these viral diseases in crops. In this context, the main objective of this thesis has been to study the distribution of aphid-transmitted viruses in cucurbit crops in Spain by monitoring different agricultural farms in the regions of Murcia, Alicante and Castilla-La Mancha, including the analysis of the genetic diversity and population structure of the main viruses, and the effect of mixed infections on the epidemiology of the diseases. First, the distribution of the main aphid-transmitted viruses in two cucurbit crops (melon and zucchini) was studied using symptomatic samples with yellowing and mosaics from three producing regions in Spain (Region of Murcia, Alicante and Castilla La-Mancha) during 10 consecutive years (2011-2020). The main viruses detected were cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV) and watermelon mosaic virus (WMV). Other viruses, such as zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), cucumber mosaic virus (CMV), watermelon Moroccan mosaic virus (MWMV) and papaya ringspot virus (PRSV) were also detected, but in lower frequency and mainly in mixed infections. Additionally, the detection of CABYV and WMV in the same sample was the most frequently observed viral combination in all crops, production areas and seasons. Statistical analyses showed a significant association between CABYV and WMV infections, suggesting that mixed infections could be influencing the evolutionary epidemiology of these viral diseases. Therefore, genetic characterisation of 24 CABYV isolates and 22 WMV isolates was carried out by complete genome sequencing using high-throughput single-molecule real-time sequencing technology (SMRT, PacBio). Analysis of the WMV population showed that most isolates clustered in the emergent clade with no genetic differentiation between them and reduced genetic variability. Similarly, CABYV analysis revealed that most CABYV isolates clustered in the Mediterranean clade, with no apparent genetic differentiation between populations by producing region or crop. However, analysis of molecular variance (AMOVA) showed a temporal structure, with differentiation partially explained by molecular variation among isolates from samples with single and mixed infections. These results highlight the importance of understanding the molecular epidemiology of aphid-transmitted viruses in these crops, as well as the role of mixed infections in the population structure of CABYV. Secondly, the distribution of aphid-transmitted viruses was studied in two other cucurbit crops (watermelon and pumpkin) showing yellowing symptoms during the 2018-2020 seasons in the same production areas in Spain (Murcia, Alicante and Castilla-La Mancha). Once again, it was confirmed that CABYV was the most prevalent virus in both crops. Additionally, except for pumpkin in Castilla-La Mancha and Alicante, WMV was also found with high frequency in both crops in Murcia. Furthermore, during surveys in watermelon crops in 2018, pronounced yellowing symptoms were observed, which recurred in 2019 and could be associated with viruses. Our analyses identified that these new yellowing symptoms were caused by a new variant of CABYV, which was genetically and phenotypically characterized through the molecular construction of two infectious clones of CABYV (CABYV-LP63 and CABYV-MEC12). In addition to fulfilling Koch's postulates, comparative analyses showed that the CABYV-LP63 isolate from the new variant had a higher viral load in the five tested cucurbit species (melon, watermelon, squash, zucchini and cucumber). Taken together, these results suggest the presence of a new CABYV variant affecting watermelon crops and with the potential to spread to the rest of the cucurbit crops. Thirdly, we examined the distribution of viruses producing mosaic symptoms in the same watermelon and squash crops during the same growing seasons (2018-2020) and same producing areas (Murcia, Alicante and Castilla-La Mancha). Our study revealed that WMV was mainly found (53%) in both crops, with an inadvertent presence of MWMV. The influence of mixed infections on WMV and MWMV viral dynamics was also studied through the construction of infectious clones of WMV (MeWMV7) and MWMV (ZuM10). Our analyses showed that the viral load of each virus varied significantly depending on the infected plant species and the type of infection (single or mixed). These results suggested that the limited presence of MWMV in cucurbit crops could be a consequence of the high distribution of WMV in the cultivated plant species Finally, based on the collection of CABYV and WMV nucleotide sequences, the phylodynamics of viral populations were studied at a global level through coat protein (CP) and complete genome (CG) sequences using the Nextstrain platform. On the one hand, the analysis confirmed that CABYV isolates cluster into three groups (Asian, Mediterranean and recombinant), suggesting that the CABYV epidemic likely originated in the 1400s in Southeast Asia, with the Mediterranean population emerging in Spain in the 1700s. Furthermore, the CABYV population exhibits significant divergence between Asian and Mediterranean isolates, with low genetic diversity within these populations. Hierarchical analysis of variance revealed significant differentiation between CABYV populations grouped by geographic location and within host. On the other hand, global phylogenetic reconstruction of the WMV population confirmed that isolates are clustered into two groups, classical and emergent. Nextstrain analysis suggested that WMV epidemics probably originated in the USA in the 1600s, while the initial classical population diverged in the 1800s and the emergent population diverging in the 1900s. The analysis confirms that the WMV population has an apolyphyletic origin with extensive genetic diversity. In this regard, this work highlights the importance of understanding the evolutionary dynamics of pathogens at a global scale, which is crucial for the development of effective and long-lasting control strategies. In general, the results obtained in this thesis emphasise the importance of studying the molecular epidemiology of viruses affecting crops, as well as the relevance of understanding the evolutionary dynamics of viruses at regional and global levels. Furthermore, it highlights the impact that mixed infections can have on the epidemiology and evolutionary dynamics of viral populations.