Nuevas aportaciones nanotecnológicas en el desarrollo de metodologías analíticas agroalimentarias
- Autores: Vanesa Román Pizarro
- Directores de la Tesis: Juan Manuel Fernández Romero (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Córdoba (ESP) ( España ) en 2023
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Alberto Escarpa Miguel (presid.), Maria de la Paz Aguilar Caballos (secret.), Axel Dürkop (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Química Fina por la Universidad de Córdoba
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Helvia
- Resumen
1. Introducción o motivación de la tesis:
La utilización de nanomateriales (NMs) como herramientas en el desarrollo de metodologías analíticas ha abierto nuevas posibilidades en cuanto a la mejora de propiedades analíticas, tales como la sensibilidad y la selectividad, a la par que otras propiedades relativas al funcionamiento relacionadas con el consumo de reactantes, coste y frecuencia de muestreo. Las buenas resultados obtenidos por el uso de nanomateriales han dado lugar a la expansión de la nanotecnología en diferentes áreas del análisis agroalimentario, ambiental y clínico utilizándola en diversas técnicas de separación y determinativas. La integración de la nanotecnología en las metodologías analíticas es atribuible a las nuevas propiedades estructurales, ópticas, electrónicas y catalíticas que presentan los nuevos nanomateriales desarrollados y que se pretenden aprovechar en sus usos como reactivos alternativos a los reactivos convencionales, tales como las moléculas orgánicas. En este sentido, durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral se han propuesto diferentes procedimientos de síntesis de dos tipos de nanoestructuras (NEs); nanopartículas y liposomas, así como su utilidad en el desarrollo de metodologías de análisis con una participación concreta en la aplicabilidad en la determinación de compuestos emergentes en las áreas ya comentadas. Se han desarrollado procedimientos de síntesis de nanopartículas metálicas de oro (AuNPs), magnéticas (MNPs) con y sin modificaciones de la superficie, de nanoesferas híbridas sintetizadas a partir de núcleos constituidos por magnetita y la formación de estructuras poliméricas tipo core-shell de formaldehido/fenol y dopadas con AuNPs. También se han desarrollado NEs de tipo liposomas (Ls) en base a su estructura fosfolipídica en los que se han unido o encapsulado diferentes NPs ya sintetizadas, junto con otros reactivos (fluoróforos, enzimas, sustratos y cofactores), para originar liposomas híbridos (h-Ls) con diferente funcionalidad. Además de los procedimientos de síntesis, separación/purificación, estabilización y caracterización de estas nanoestructuras, se han desarrollado metodologías analíticas de respuesta rápida, utilizando sistemas dinámicos convencionales y microfluídicos en los que se han aprovechado las características de los NMs involucrados y las innovaciones nanotecnológicas aportadas para la determinación de diferentes compuestos de interés en agroalimentación, cuyos modelos pueden ser exportados a otras áreas de aplicación.
2.Contenido de la investigación:
En las investigaciones realizadas se han propuesto diferentes metodologías en la que se han se han incorporado algunas modificaciones en los procedimientos de síntesis, derivatización, estabilización, purificación y caracterización de liposomas híbridos (h-Ls) para su uso como contenedores analíticos que se desplazan a lo largo de sistemas dinámicos. Estos liposomas pueden sufrir diferentes procesos de retención y, en su caso, liberación controlada del contenido en la zona de reacción/detección de los sistemas de flujo que operan en modo convencional (Bloque III), así como aquellos sistemas que evolucionan a escala microfluídica (Bloque IV).
Se han llevado a cabo distintos procedimientos para la síntesis y purificación de NPs metálicas y magnéticas y su posterior funcionalización con diferentes compuestos para modificar su operatividad dentro de los procesos analíticos desarrollados. Se presentan también, métodos de síntesis como el método de evaporación rápida de disolvente (RSE), y métodos de homogenización y purificación de liposomas con el fin de obtener poblaciones uniformes de los mismos. Se ha estudiado la capacidad de los liposomas como dispositivos de encapsulamiento y la posterior liberación de estos reactivos encapsulados. Para la caracterización física y estructural de todos los nanomateriales sintetizados se han utilizado diferentes procedimientos mediante técnicas microscópicas ópticas (convencional, de fluorescencia, confocal y AFM), electrónica (TEM, SEM-EDX), espectroscópicas (absorción, emisión, FTIR) y estructurales (XPS, DLS y NTA). Se ha investigado el diseño de nuevas configuraciones dinámicas utilizando distintos sistemas de flujo para el desarrollo de metodologías automáticas en las que los nuevos nanomateriales contribuyen a mejorar las características analíticas de las determinaciones propuestas.
En un primer trabajo se presenta un método de síntesis de AuNPs y su funcionalización con dodecanotiol (DT) que al dotarlas de carácter hidrofóbico facilita su encapsulamiento en los liposomas. Estos liposomas híbridos se homogenizan mediante la aplicación de ultrasonidos y posteriormente se lleva a cabo su separación por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. En este sistema se usan liposomas híbridos con AuNPs encapsuladas para determinar biotina mediante un sistema en flujo convencional, basándose en la reacción competitiva entre los liposomas híbridos biotinilados y la proteína avidina. Este método se aplica a la determinación de biotina en muestras de alimentos lo cual no había sido descrito hasta ahora además de presentar unos límites de detección más bajos que otros métodos [1]En el segundo trabajo se aborda la síntesis y aplicabilidad analítica de nanoestructuras híbridas, formadas por nanopartículas magnéticas y de oro (Fe3O4-AuNPs) encapsuladas en liposomas. Se ha estudiado la utilidad de estos liposomas como micro-contenedores que protegen los reactantes en su traslado a lo largo del sistema de flujo mejorando las características del proceso analítico determinativo. Con este fin se ha usado un dispositivo electromagnético acoplado en el sistema de flujo, el cual permite la preconcentración de los h-MLs en la zona adecuada del sistema. Posteriormente se procede a la ruptura de los h-MLs, produciéndose la liberación de los reactivos encapsulados, lo que favorece el desarrollo integrado de la reacción química y la etapa de detección. El nuevo sistema propuesto se ha aplicado a la determinación de la actividad fosfatasa alcalina (ALP) en alimentos, encapsulando un sustrato de esta enzima junto con las NPs híbridas en los liposomas [2].
Con objeto de estudiar la aplicabilidad de nanoesferas híbridas tipo core-shell (Fe3O4@PFR@AuNP) multifuncionales que exhiben simultáneamente propiedades magnéticas y efectos de activación/inhibición de fluorescencia con transferencia de energía resonante (FRET) en función de la presencia de compuestos capaces de interaccionar selectivamente con estas NEs. Se ha desarrollado un método en batch para la determinación de derivados tiólicos en muestras ambientales [3].
Por otra parte, se han desarrollado dos tipos de h-MLs para aplicarlos a la determinación de analitos de interés en el ámbito agroalimentario. En el primer tipo se ha encapsulado el fluoróforo de larga longitud de onda (LWF) violeta de cresilo, para su preconcentración previa al detector y su posterior liberación e interacción con la coenzima Q10 (ubiquinona). Este sistema ha dado lugar a un método para la determinación de coenzima Q10 en alimentos [4]. En el segundo tipo de h-MLs se ha encapsulado el LWF naftofluoresceína y se han estudiado las condiciones óptimas para su traslado, preconcentración, liberación y mezcla del indicador redox previamente al su paso por el detector. Mediante este sistema se ha desarrollado un método para la determinación de peróxidos en alimentos como leche y aceites vegetales [5].
Se ha propuesto dos metodologías para la determinación de colesterol en fluidos biológicos utilizando en cada caso sistemas dinámicos de flujo a escala convencional y microfluídica, basados en la inmovilización y retención magnética en la zona del detector de las enzimas colesterol esterasa (ChE) y colesterol oxidasa (COx) que han sido previamente inmovilizadas sobre nanopartículas magnéticas mediante reacción con un derivado de la carbodiimida (EDC). El peróxido de hidrógeno formado en la secuencia de reacciones enzimáticas se monitoriza fluorimétricamente utilizando naftofluoresceína como indicador redox, ya que éste oxida a la naftofluoresceína y provoca una disminución de su fluorescencia que es proporcional a la concentración de colesterol [6 y 7].
Finalmente, se ha desarrollado un método para la determinación de inhibidores de enzima lacasa en alimentos. Para ello se han sintetizado nanopartículas funcionalizadas con ácido oleico para dar carácter hidrófobo a las mismas y se unen mediante enlace covalente con la enzima lacasa (MNPs-Lac). Estas MNPs-Lac se encapsulan dentro de los h-MLs junto con el indicador redox HPTS. Se han utilizado estos Ls las como contenedores analíticos en los que se aprovecha sus facilidades para el traslado, preconcentración y liberación controlada en un sistema dinámico a escala microfluídica, para su posterior aplicación en la determinación de la presencia en alimentos de inhibidores de la enzima lacasa [8].
3.Conclusión:
En esta Tesis Doctoral se han implementado diferentes metodologías analíticas determinativas con diferente grado de integración con sistemas dinámicos desarrollados bajo un régimen de flujo convencional o microfluídico, para la determinación de diferentes analitos tales como vitaminas, enzimas o sus compuestos afines (incluyendo cofactores, sustratos, activadores e inhibidores) o compuestos reactivos de oxígeno, fundamentalmente en muestras agroalimentarias, medioambientales o clínicas. A continuación, se resumen las conclusiones más relevantes derivadas de las investigaciones desarrolladas: [1] Se han presentado innovaciones en los procedimientos de síntesis, purificación y estabilización de nanopartículas metálicas y magnéticas, así como en la funcionalización de estas con compuestos que permitan modificar sus propiedades estructurales y funcionales.
- Se han sintetizado nanopartículas metálicas de oro modificadas con dodecanotiol (AuNPs-DT) haciendo su superficie hidrofóbica y que se han utilizado para su incorporación en la bicapa lipídica de liposomas híbridos. Esta misma estrategia se ha utilizado en la síntesis de NPs metálicas híbridas con núcleo de magnetita recubiertas a su vez con AuNPs hidrofóbicas (Fe3O4@AuNP-DT) y que se han usado de forma similar en sistemas dinámicos para facilitar su retención magnética en determinadas zonas de sistema de flujo.
- Se han sintetizado nanopartículas híbridas mediante funcionalización covalente con diferentes enzimas, en las que se ha modificado la actividad superficial del NM según la necesidad de que la retención del complejo NMs-enzima se precise de NEs con carácter hidrofílico o hidrofóbico. Se han inmovilizado la enzima colesterol esterasa (ChE) y colesterol oxidasa (ChOx) sobre MNPs de núcleo de magnetita con objeto de inmovilizar mezclas de ambas enzimas en la zona de reacción/detección en sistemas dinámicos. También se han sintetizado complejos formados por la unión de MNPs hidrófobas con enzima lacasa para provocar la retención de la enzima en la bicapa lipídica y a su vez facilitar la retención magnética de los magnetoliposomas en la zona de reacción/detección del sistema microfluídico.
- Se han sintetizado nanoesferas híbridas con estructura core-shell (Fe3O4@PFR@AuNP) con un núcleo de magnetita recubierta de una resina sintética formada a partir de la policondensación sol-gel de fenol y formaldehido y dopadas con AuNPs. Esta nanoesferas híbridas posibilitan el desarrollo de reacciones basadas en fenómenos luminiscentes con transferencia de energía resonante (FRET) y su aprovechamiento para determinar compuestos que activan o inhiben este efecto en las nanoesferas. [2] Se han sintetizado liposomas híbridos en los que se han incorporado nanomateriales metálicos dopados y/o magnéticos, que se han encapsulados junto con otros reactivos, tales como fluoróforos, enzimas o substratos enzimáticos. Estas actuaciones han permitido modificar y en su caso mejorar las propiedades morfológicas, estructurales y funcionales de los liposomas. [3] Se han utilizado estos liposomas híbridos como contenedores analíticos para el transporte, confinamiento, estabilización, protección y liberación de su contenido en la zona de detección de los sistemas de flujo convencionales y microfluídicos, permitiendo de este modo la interacción con los analitos con otros reactantes en esta zona, lo que ha constituido una integración de la zona de reacción/detección a modo de sistemas biosensores miniaturizados. [4] Se ha demostrado la utilidad analítica de los métodos propuestos mediante su aplicación en muestras con diferentes matrices para la determinación de metabolitos, vitaminas, enzimas y contaminantes emergentes en muestras medioambientales, agrícolas y clínicas.
4. Bibliografía:
[1] V. Román-Pizarro, J.M. Fernández-Romero, A. Gómez-Hens, A. Gold nanoparticle-biotinylated liposome hybrids as analytical reagents for biotin determination using a competitive assay and resonance light scattering detection. Talanta 99 (2012) 538-543. DOI: 10.1016/j.talanta.2012.06.029.
[2] V. Román-Pizarro, J.M. Fernández-Romero, A. Gómez-Hens, Fluorometric determination of alkaline phosphatase activity in food using magnetoliposomes as on-flow microcontainer devices. (2014) J. Agric. Food Chem., 62 (2014) 1819-1825. DOI: 10.1021/jf5004804.
[3] V. Román-Pizarro, J.M. Fernández-Romero, A. Gómez-Hens, A general thiol assay based on the suppression of fluorescence resonance energy transfer in magnetic-resin core-shell nanospheres coated with gold nanoparticles. Microchim. Acta, 182 (2015) 2285-2292. DOI: 10.1007/s00604-015-1579-4.
[4] V. Román-Pizarro, J.M. Fernández-Romero, A. Gómez-Hens, Automatic determination of coenzyme Q10 in food using cresyl violet encapsulated into magnetoliposomes. Food Chem. 221 (2017) 864-870. DOI: 10.1016/j.foodchem.2016.11.085.
[5] V. Román-Pizarro, A. Gómez-Hens, J.M. Fernández-Romero, Applicability of Fluorescent Hybrid Magnetoliposomes for the Determination of Reactive Oxygen Compounds in Food. Food Anal Methods, 11 (2018) 2376-2383. DOI: 10.1007/s12161-018-1220-3.
[6] V. Román-Pizarro, M. Ramirez- Gutierrez J.M. Fernández-Romero, A. Gómez-Hens, Usefulness of magnetically controlled MNPs-enzymes microreactors for the fluorometric determination of total cholesterol in serum. Talanta, 208 (2020) 120426. DOI: https://doi.org/10.1016/j.talanta. 2019.120426.
[7] V. Román-Pizarro, J.M. Fernández-Romero, An integrated microfluidic biosensor based on magnetically retained enzyme-nanoparticles for cholesterol monitoring with fluorometric detection. (Enviado para su publicación a Microchim. Acta, 2023).
[8] Román-Pizarro, V., Hermann, C., Hirsch, T., Fernández-Romero, J.M., Microfluidic determination of enzyme inhibitors in beverages using encapsulated laccase-MNPs in liposomes with fluorescence detection. (Enviado para su publicación a Talanta, 2023).
