Estudio de los microRNAs como biomarcadores no invasivos de rechazo post-trasplante cardiaco

• Autores: Ignacio Pedro Constanso Conde
• Directores de la Tesis: Lucía Núñez Fernández (dir. tes.), María Generosa Crespo Leiro (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidade da Coruña ( España ) en 2024
• Idioma: español
• Número de páginas: 119
• Tribunal Calificador de la Tesis: Arturo González Quintela (presid.), Susana Sangiao Alvarellos (secret.), Iris Paula Garrido Bravo (voc.)
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: RUC
• Resumen
  • español

    INTRODUCCIÓN: el rechazo celular agudo (RCA) es una complicación importante tras un trasplante cardiaco (TxC). La biopsia endomiocárdica (BEM) es el método de referencia para la detección precoz de ese RCA, pero tiene importantes limitaciones. Entre éstas destacan ser invasivo, un probable error de muestreo, el alto coste y la interpretación subjetiva que provocan gran variabilidad en los informes del patólogo. Por ello, sería de gran utilidad encontrar un biomarcador no invasivo de detección de RCA en el paciente trasplantado. Entre los posibles candidatos se encuentran los microRNAs circulantes. El estudio central de esta tesis tiene como objetivo principal seleccionar y validar microRNAs en muestras de suero para la detección precoz de RCA en el seguimiento del TxC.

    MÉTODOS: en este estudio prospectivo, observacional y unicéntrico se incluyeron a 121 pacientes con TxC. El RCA en base a la BEM se clasificó según la International Society of Heart and Lung Transplantation (ISHLT) del 2004, existiendo 4 grados: “0R” sin rechazo, “1R” rechazo leve, “2R” rechazo moderado, “3R” rechazo grave. Inicialmente, en una fase inicial de búsqueda, se llevó a cabo un experimento con perfiles de expresión de microARNs en los sueros de los pacientes pre-RCA “0RS1“, durante el RCA “2RS2” y post-RCA “0RS3”. Al episodio enteró se le llamó “0RS1 →2RS2 →0RS3”. Se analizaron 179 microRNAs en cada suero mediante RT-qPCR (Reverse Transcriptase quantitative Polimerase Chain Reaction) y se seleccionaron aquellos microRNAs con un patrón de subida/bajada (o viceversa) significativa durante el episodio “0RS1 →2RS2 →0RS3”. En la fase siguiente de validación se comprobará la eficacia diagnóstica para detectar RCA de los microRNAs seleccionados. Para esto se buscarán nuevas muestras de suero para formar dos grupos nuevos de pacientes, un grupo sin rechazo “NoR” y otro con RCA (BEM≥2R).

    RESULTADOS: en la fase inicial de búsqueda se analizaron microRNAs en un total de 21 episodios de RCA “0RS1 →2RS2 →0RS3”, y sus respectivas muestras de suero (n = 63). De entre los 179 microARN analizados, solo miR-181a-5p cumplió los criterios establecidos de subida y bajada significativa y por tanto, el único microRNA seleccionado para la siguiente fase. En la validación, miR-181a-5p se analizó en 45 muestras con RCA y 45 muestras sin RCA, encontrándose significativamente sobreexpresado en el grupo con RCA. El candidato miR-181a-5p, además, alcanzó un área bajo la curva AUC = 0,804 (IC 95 %: 0,707-0,880), y una sensibilidad y especificidad del 78% y 76%, respectivamente, con un alto valor predictivo negativo (98%).

    CONCLUSION: miR-181a-5p ha demostrado muy buenas cualidades como biomarcador no invasivo de RCA en el TxC. Un alto valor predictivo negativo junto con un reducido coste y simplicidad de análisis, justificarían su uso como ayuda en el manejo y seguimiento del paciente trasplantado cardiaco.

  • English

    INTRODUCTION: acute cellular rejection (ACR) is an important complication after heart transplantation (HTx). Endomyocardial biopsy is the reference method for the early detection of this ACR, but it has important limitations. These include being invasive, the probable sampling error, the high cost and the subjective interpretation of the pathologist, which cause great variability in the final results. Therefore, it would be very useful to find a non-invasive biomarker for detecting ACR in the transplant patient. Among the possible candidates are circulating microRNAs. The main objective of the central study of this thesis is to discover and validate microRNAs in serum samples for the early detection of ACR in the follow-up of HTx.

    METHODS: 121 HTx patients were included in this prospective, observational, single-center study. RCA based on EMB was classified according to the International Society of Heart and Lung Transplantation (ISHLT) in 2004, with 4 grades: “0R” without rejection, “1R” mild rejection, “2R” moderate rejection, “3R” rejection serious. Initially, in an initial search phase, an experiment was carried out with microRNA expression profiles in the serum of pre-RCA patients “0RS1”, during rejection “2RS2” and after rejection “0RS3”. The entire episode was called “0RS1 →2RS2 →0RS3”. A total of 179 microRNAs in each serum were analyzed by RT-qPCR (Reverse Transcriptase quantitative Polymerase Chain Reaction) and those microRNAs with a significant rise/fall pattern (or vice versa) during the episode “0RS1 →2RS2 →0RS3” were selected. The next validation phase will check the diagnostic efficacy to detect RCA of the selected microRNAs. For this, new serum samples will be sought to form two new groups of patients, a group without “NoR” rejection and another with ACR (BEM≥2R). RESULTS: in the initial search phase, microRNAs were analyzed in a total of 21 episodes of RCA “0RS1 →2RS2 →0RS3”, and their respective serum samples (n = 63). Among the 179 microRNAs analyzed, only miR-181a-5p met the criteria for significant up- and down-regulation and therefore, the only microRNA selected for the next phase. In validation, miR-181a-5p was analyzed in 45 samples with RCA and 45 samples without RCA, being found significantly overexpressed in the group with RCA. The miR-181a-5p candidate also achieved an area under the curve AUC = 0.804 (95% CI: 0.707-0.880), and a sensitivity and specificity of 78% and 76%, respectively, with a high negative predictive value (98%).

    CONCLUSION: miR-181a-5p has demonstrated very good qualities as a non-invasive biomarker of ACR in HTx. A high negative predictive value together with a reduced cost and simplicity of analysis would justify its use as an aid in the management and monitoring of the heart transplant patient.

  • galego

    INTRODUCIÓN: o rexeitamento celular agudo (RCA) é unha complicación importante despois do trasplante cardíaco (TxC). A biopsia endomiocárdica (BEM) é o método de referencia para a detección precoz deste RCA, pero ten importantes limitacións. Estes inclúen ser invasivo, o probable erro de mostraxe, o alto custo e a interpretación subxectiva do patólogo, que provocan unha gran variabilidade nos resultados finais. Polo tanto, sería moi útil atopar un biomarcador non invasivo para detectar RCA no paciente trasplantado. Entre os posibles candidatos están os microRNA circulantes. O obxectivo principal do estudo central desta tese é descubrir e validar microRNA en mostras de soro para a detección precoz de RCA no seguimento de TxC.

    MÉTODOS: 121 pacientes con HTx foron incluídos neste estudo prospectivo, observacional, dun centro. A RCA baseada en BEM foi clasificada segundo a Sociedade Internacional de Trasplante de Corazón e Pulmón (ISHLT) en 2004, con 4 graos: "0R" sen rexeitamento, "1R" rexeitamento leve, "2R" rexeitamento moderado, "3R" rexeitamento grave. Inicialmente, nunha fase de busca inicial, realizouse un experimento con perfís de expresión de microRNA nos soros de pacientes pre-RCA “0RS1”, durante RCA “2RS2” e post-RCA “0RS3”. Todo o episodio chamouse "0RS1 →2RS2 →0RS3". Analizáronse 179 microRNA en cada soro mediante RT-qPCR (Reacción en cadea da polimerase cuantitativa da transcriptase inversa) e seleccionáronse aqueles microARN cun patrón de subida/descenso significativo (ou viceversa) durante o episodio "0RS1 →2RS2 →0RS3". A seguinte fase de validación comprobará a eficacia diagnóstica para detectar RCA dos microRNA seleccionados. Para iso, buscaranse novas mostras de soro para formar dous novos grupos de pacientes, un grupo sen rexeitamento “NoR” e outro con RCA (BEM≥2R).

    RESULTADOS: na fase de busca inicial analizáronse os microRNA nun total de 21 episodios de RCA “0RS1 →2RS2 →0RS3”, e as súas respectivas mostras de soro (n = 63). Entre os 179 microANAs analizados, só o miR-181a-5p cumpriu os criterios para unha regulación significativa ao alza e á baixa e, polo tanto, o único microRNA seleccionado para a seguinte fase. Na validación, miR-181a-5p analizouse en 45 mostras con RCA e as mesmas sen RCA, encontrándose significativamente sobreexpresada no grupo con RCA. O candidato miR-181a-5p tamén logrou unha área baixo a curva de 0,804 (IC 95%: 0,707-0,880), e unha sensibilidade e especificidade do 78% e 76%, respectivamente, cun alto valor preditivo negativo (98%).

    CONCLUSIÓN: miR-181a-5p demostrou moi boas calidades como biomarcador non invasivo de RCA en TxC. Un alto valor preditivo negativo xunto cun custo reducido e sinxeleza de análise xustificarían o seu uso como axuda na xestión e seguimento do paciente trasplantado cardiaco.