Estrategias (bio) analíticas basadas en el empleo de nanopartículas de oro para la detección de biomarcadores genéticos

• Autores: Adrián Sánchez Visedo
• Directores de la Tesis: María Teresa Fernández Fernández-Argüelles (dir. tes.), Francisco J. Ferrero Martín (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Oviedo ( España ) en 2022
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Juan Carlos Campo Rodríguez (presid.), María Luisa Fernández Sánchez (secret.), Laura Rodríguez Lorenzo (voc.), Alfonso Salinas Castillo (voc.), Mario Menéndez Miranda (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Análisis Químico, Bioquímico y Estructural y Modelización Computacional por la Universidad de Oviedo
• Materias:
  • Física
    • Química física
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• Resumen

  • El objetivo de la Tesis Doctoral consiste en el desarrollo de estrategias (bio)analíticas basadas en el empleo de nanomateriales para la detección óptica, rápida y sencilla de biomarcadores genéticos relacionados con infecciones. Para ello, se han seleccionado nanopartículas de oro (AuNPs) como marcas debido a sus excelentes propiedades optoelectrónicas, y a que su modificación superficial con ADN es sencilla y está muy estudiada. Se han desarrollado diferentes metodologías analíticas, y el trabajo desarrollado se ha estructurado en tres capítulos: Capítulo 1. Detección visual de miRNA usando AuNPs, y desarrollo de un dispositivo de medida portátil. En el primer capítulo se ha desarrollado una metodología analítica para realizar la detección de un microRNA (miR146a) implicado en la respuesta inmune de la mastitis bovina. Para ello, se han sintetizado, funcionalizado y caracterizado AuNPs de diferentes tamaños con sondas de ADN. La metodología propuesta se realiza en 20 minutos en condiciones isotérmicas suaves, y es posible realizar la detección visual del analito sin necesidad de instrumentación. La lectura de los resultados puede ser fácilmente interpretada por personal no cualificado, siendo un método rápido, económico y sensible. Además, se ha desarrollado un prototipo instrumental portátil de bajo coste para medir los cambios de color generados tras la interacción de las AuNPs con la secuencia de miR146a. En este caso, se ha diseñado un dispositivo de fibra óptica que permite realizar medidas de transmitancia sincronizadas a diferentes longitudes de onda. El método de medida propuesto ajusta automáticamente la potencia lumínica de salida a través de los LEDs, minimizando eventuales diferencias de brillo y pérdidas a través de la fibra óptica sin necesidad de costosos componentes ópticos. El equipo es portátil y se gestiona con un smartphone. Capítulo 2. Empleo de enzimas de ácido nucleico como herramienta de amplificación de la señal para la detección de miARN. Se pretende aprovechar las propiedades catalíticas de los denominados Enzimas de Ácido Nucleico Multicomponente (MNAzima) para realizar una amplificación isotérmica de la señal junto con AuNPs. El miR146a ha sido de nuevo seleccionado como analito para desarrollar dos metodologías analíticas diferentes. En primer lugar, se ha desarrollado un ensayo de detección visual basado en cambios en el estado de agregación de las AuNPs, aprovechando la capacidad de los MNAzimas para romper hebras genéticas. El límite de detección (LD) alcanzado es de 12 pM. Esta amplificación presenta las ventajas de ser rápida, isotérmica, a temperaturas suaves y puede adaptarse fácilmente a la detección de otros miRNAs. El uso de AuNPs favorece una fácil lectura del ensayo, que puede realizarse de forma visual o espectrofotométrica. Además, se ha desarrollado un ensayo basado en un fenómeno de Fluorescencia con Transferencia de Energía (FRET) entre una molécula fluorescente (donador) y las AuNPs (aceptor), donde la presencia de miR146a produce un aumento de la señal de fluorescencia. La metodología propuesta ha resultado ser altamente sensible y específica, logrando un amplio rango lineal con un LD de 30 fM. Capítulo 3. Doble amplificación para detección altamente sensible y visual de bacterias patógenas presentes en Sepsis Neonatal de Transmisión Vertical La sepsis neonatal de transmisión vertical es una enfermedad causada por la transmisión de bacterias patógenas presentes en el tracto genital materno al recién nacido. Provoca un alto porcentaje de morbilidad y mortalidad, por lo que es muy importante realizar el diagnóstico y tratamiento lo antes posible. En este capítulo se han seleccionado como biomarcadores secuencias de ADN específicas presentes de las bacterias patógenas E. faecalis y S. agalactiae. Debido a la bajísima concentración de estos patógenos en la sangre del recién nacido, se propone aprovechar la combinación de dos estrategias de amplificación isotérmica para su detección. En la primera amplificación, la Recombinase Polymerase Amplification (RPA) produce una réplica de una secuencia específica que pertenece a la bacteria en estudio. Posteriormente, la detección del amplicón amplificado se lleva a cabo con un segundo paso de amplificación utilizando MNAzimas. La combinación de ambas estrategias de amplificación ha permitido mejorar el LOD en dos órdenes de magnitud (en comparación con un solo paso de amplificación usando MNAzimas), permitiendo la detección de bacterias patógenas a temperaturas suaves en poco tiempo.