Regulación de la actividad y localización subcelular del canal de CA2+ ORAI1 por el citoesqueleto en el frente de migración

• Autores: Noelia Espinosa Bermejo
• Directores de la Tesis: Francisco Javier Martín Romero (dir. tes.), Eulalia Pozo Guisado (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Extremadura ( España ) en 2023
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Javier de Francisco Morcillo (presid.), Carlos Pascual Caro (secret.), Francesc Tebar Ramón (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomarcadores de Salud y Estados Patológicos por la Universidad de Extremadura
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
  • Ciencias de la vida
    • Biología celular
    • Fisiología humana
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TESEO  Dehesa 
• Resumen
  • español

    La migración celular es un proceso fisiológico que requiere de la reorganización del citoesqueleto de actina para la formación de protrusiones de membrana y generar un frente de migración polarizado. Esta reorganización del citoesqueleto se conoce como ruffling (ondulaciones) de membrana y es activada por la polimerización de la actina cortical a través del complejo ARP2/3 y la proteína WAVE mediante un proceso regulado por la actividad RAC1. Se conoce que la entrada de Ca2+ extracelular y la organización espaciotemporal de la [Ca2+]i es esencial en la reorganización del citoesqueleto durante la migración celular. En este sentido, numerosos estudios han mostrado que SOCE (entrada de calcio operada por el vaciado de depósitos intracelulares) es esencial para la migración celular. Así, el objetivo principal de esta Tesis Doctoral es estudiar el papel de la proteína ORAI1 en el frente de migración celular.

    Para desarrollar esta investigación se ha utilizado la línea celular de osteosarcoma humano U2OS, una línea celular con alta actividad tumorigénica. Esta línea celular se modificó mediante edición genómica con CRISPR/Cas9 para suprimir la expresión de ORAI1, y nuestros resultados muestran que las células deficientes en ORAI1 (ORAI1-KO) presentan una reducción significativa del ruffling de membrana, lo cual conduce a una pérdida de la persistencia direccional y a la ralentización de la migración celular. Además, la ausencia de ORAI1 disminuye el potencial invasivo de las células U2OS en el pez cebra (Danio rerio), mutante casper, como modelo animal, lo que sugiere que ORAI1 participa directamente tanto en procesos de migración tumoral como en procesos metastáticos. En este trabajo hemos observado que mediante un mecanismo dependiente de la actividad RAC1, que puede ser estimulado por EGF, ORAI1 interacciona con CTTN, ARP2/3 y CYFIP1, que son agentes promotores de la nucleación de actina para la generación de lamelipodios en el frente de migración. Además, mediante el análisis de la fosforilación de residuos de ORAI1 hemos observado que la inhibición de la fosforilación de la Thr295 y Ser298 induce un aumento en la entrada de Ca2+ en la célula y un enriquecimiento de ORAI1 en vesículas intracelulares, lo que pone de manifiesto un nuevo mecanismo de regulación de SOCE a través de la fosforilación/desfosforilación de estos residuos.

    En conjunto, estos resultados nos permiten establecer un modelo en el cual ORAI1 forma parte de un complejo macromolecular junto a CTTN, ARP2/3 y CYFIP1 en el frente de migración, en el cual RAC1 controla la translocación de ORAI1 a la membrana plasmática, donde participa en la señalización de Ca2+ polarizada y en la generación del ruffling de membrana.

  • English

    Cell migration requires reorganization of the actin cytoskeleton for the formation of membrane protrusions and a polarized leading edge. This reorganization of the cytoskeleton is known as membrane ruffling and is activated by the polymerization of cortical actin through the ARP2/3 complex and the WAVE protein in a process regulated by RAC1 activity. Given the importance of the Ca2+ ion in migration, in this PhD thesis we have studied the role in the leading edge of the ORAI1 protein, a membrane cannel involved in SOCE (store operated Ca2+ entry). Using the human osteosarcoma cell line U2OS, modified by genomic editing with CRISPR/Cas9, we have observed that cells deficient in ORAI1 show a significant reduction in membrane ruffling and a slowing of cell migration, as well as a decrease in the invasive potential of U2OS cells in the casper zebrafish animal model. Furthermore, our results show that ORAI1 translocates to the plasma membrane and interacts with CTTN, ARP2/3 and CYFIP1, actin nucleationpromoting agents for lamellipodia generation, through a RAC1 activity-dependent mechanism. Finally, we propose a mechanism of SOCE regulation by phosphorylation after observing that inhibition of Thr295 and Ser298 phosphorylation of ORAI1 induces an increase in Ca2+ entry and an enrichment of ORAI1 in intracellular vesicles.