Resumen de Desarrollo de metodología de cribado y optimización de extracción de fluidos corporales a partir de polímeros superabsorbentes (SAP) en casos de agresión sexual
María Inés Silva Gregorio Martins
- español
La Tesis Doctoral intitulada Development of methods of screening and extraction of bodily fluids in superabsorbent materials prior to genetic profiling in sexual aggression cases tuvo como objetivo desarrollar un método espectral no-invasivo de detección y diferenciación de diferentes fluidos biológicos impregnados en materiales superabsorbentes, de modo a aumentar la eficiencia del cribado para una detección confirmatoria. Además, se pretendió optimizar la extracción de fluidos biológicos de los materiales superabsorbentes, en particular semen, para el posterior análisis del perfil genético en muestras de agresiones sexuales.
En primer lugar, se recopilaron datos bibliográficos para lograr una descripción de los métodos actuales de identificación y extracción de los fluidos biológicos, identificando las varias dificultades de esos métodos analíticos. Las muestras de materiales higiénicos superabsorbentes en los casos de agresiones sexuales representan un reto para los laboratorios forenses. Estos materiales sanitarios tienen varias capas de diferente composición y capacidad de absorción. Por su composición, los materiales higiénicos superabsorbentes retienen fluidos biológicos, y se usan en el contexto forense para recuperar ADN del agresor para obtener un perfil genético. Sin embargo, su complejidad representa un problema para la identificación y extracción de fluidos biológicos en los laboratorios forenses.
En la Sección 1, un método fue desarrollado y descrito para el un cribado no-invasivo de fluidos biológicos. En este estudio, se han analizado de manera no-destructiva por Espectroscopia Infrarroja con Transformada de Fourier y Reflectancia Total Atenuada (ATR-FTIR) manchas de semen, fluido vaginal y orina impregnados en materiales higiénicos superabsorbentes, como compresas y pañales. Aunque las capas inferiores tienen la mayor capacidad de absorción, se han podido detectar los tres fluidos biológicos al analizar la capa superior de los materiales higiénicos superabsorbentes por ATR-FTIR. Esto demuestra que los fluidos biológicos se distribuirán entre todas las capas. Además, se han analizado también mezclas de los tres fluidos biológicos impregnadas en materiales higiénicos superabsprbentes y en sustratos de algodón, visto que en las investigaciones forenses de agresiones sexuales las evidencias analizadas suelen contener mezclas de diferentes fluidos. Semen y fluido vaginal se han diferenciado de orina, por la firma espectral específica de sus proteínas (región espectral de 1800 - 1480 cm-1). Sin embargo, el fluido vaginal tiene una firma espectral muy similar al semen, debido a la composición proteica muy similar de estos fluidos.
Para discriminar los fluidos biológicos sin dañar la muestra, las firmas espectrales de los fluidos obtenidos de mezclas en materiales superabsorbentes y algodón, se compararon con las firmas espectrales de muestras individuales de cada fluido aplicando un método de análisis estadístico. Definiendo diferentes umbrales, este método podrá ser aplicado para un cribado inicial para identificar las muestras que contienen semen; y, de seguida, podrá ser aplicada para una discriminación más exacta de las manchas con mayor contenido de semen. Así, el técnico forense conseguiría seleccionar las mejores muestras para proceder con la posterior extracción de ADN para intentar lograr el perfil genético del agresor. El método descrito permite obtener resultados cualitativos y fidedignos, sin interpretación humana. Como tal, el método propuesto tendría la posibilidad de ser un sistema eficiente, automatizado y barato para el cribado no-destructivo de semen, que podría ser fácilmente implementado en los laboratorios forenses.
Por otro lado, se estudió la extracción de fluidos biológicos, en particular semen, de materiales higiénicos superabsorbentes. El procedimiento actual para extracción de semen de los materiales superabsorbentes consiste en la incubación de las capas superiores, libres de SAPs, con agua. En la Sección 2, se desarrolló un protocolo de extracción de fluidos considerando todas las capas de los materiales higiénicos superabsorbentes, incluyendo la capa inferior absorbente. No existían estudios describiendo la eficiencia de recuperación de semen de las diferentes capas y una evaluación cuantitativa era necesaria. Por lo que, la subsección 2.1 fue el primer estudio publicado caracterizando diferentes materiales higiénicos superabsorbentes y evaluando la eficiencia de recuperación de semen de las capas superiores libres de SAPs. Se ha detectado semen hasta la dilución 1:25000 en las capas superiores de todos los sustratos estudiados, obteniendo una recuperación máxima de 8% para ADN masculino y de 4% para células espermáticas.
Además, se han simulado las capas inferiores absorbentes, preparando hidrogeles de poliacrilato de sodio impregnados con semen. La aplicación de diferentes tratamientos químicos seguidos de la filtración con membranas de nylon y poliéster (PETE) instaladas en tubos NAO® Baskets han permitido la extracción de semen desde los hidrogeles. La incubación con isopropanol 100% presentó la mayor recuperación de células espermáticas (6,0%).
Los resultados anteriores han demostrado la necesidad de desarrollar y optimizar el protocolo de extracción de semen de las capas inferiores, en contraste con el procedimiento actual que solo considera las capas superiores. Por lo que se realizó un estudio para analizar la eficiencia de diferentes tratamientos químicos y físicos para extraer semen de las capas inferiores de los materiales higiénicos superabsorbentes. La composición de la capa inferior consiste en sales de poliacrilato de sodio (SAPs). Los SAPs retienen fluidos biológicos y se transforman en un hidrogel, bloqueando la posibilidad de obtener células y por lo tanto de obtener el material genético. Los tratamientos químicos y físicos se han comparado para maximizar la recuperación de semen y ADN masculino de materiales superabsorbentes, como compresas y pañales. Fue posible obtener perfiles genéticos, sin interferencia química o de los SAPs, de soluciones extraídas con diferentes tratamientos de la capa inferior de los materiales higiénicos superabsorbentes. Además, se han obtenido mejores recuperaciones de semen y ADN masculino cuando extraídos de todas las capas de los materiales superabsorbentes, en comparación con la recuperación de las capas superiores. De acuerdo con los resultados de la presente Tesis, se recomienda inducir la desidratación de los hidrogeles, de manera a maximizar la extracción de fluidos biológicos. Este tipo de evidencias puede tener un impacto crucial en los casos de agresiones sexuales, por su capacidad de retener fluidos biológicos y por mantener la integridad del ADN. Sin embargo, hay un número muy reducido de estudios publicados enfocados en la optimización de la extracción de los fluidos biológicos de los materiales higiénicos superabsorbentes.
- English
This Doctoral Thesis entitled “Development of methods of screening and extraction of bodily fluids in superabsorbent materials prior to genetic profiling in sexual aggression cases” aimed to develop a spectral non-invasive method to detect and identify different bodily fluids in superabsorbent materials to improve the screening efficiency for confirmatory bodily fluid detection and, secondly, to optimize the posterior extraction of bodily fluids from those materials, particularly semen, to further obtain the genetic profile of interest in the sexual aggression sample.
Firstly, a bibliographic context was compiled in order to introduce the current methods of identification and extraction of bodily fluids, and to enumerate several challenges of those techniques. One of the discussed challenges was the analysis of superabsorbent sanitary pads as evidence in sexual aggression cases. Superabsorbent pads consist on different layers with different composition and different absorption capacity, being the lower layer the most absorbent. Due to their composition, superabsorbent pads retain bodily fluids, and can be used for forensic laboratories to retrieve DNA for a genetic profile. However, due to their complexity, the identification and extraction of bodily fluids from superabsorbent pads certainly presents a current challenge in the forensic laboratories.
Next, in Chapter 1, a method for non-destructive screening of bodily fluid samples was developed and described. In this study, semen, vaginal fluid and urine stains placed on superabsorbent pads including sanitary napkins, panty-liners and diapers were nondestructively detected by Attenuated Total Reflectance (ATR) Fourier Transform Infrared spectroscopy (FTIR). In spite of the higher absorbent capacity of the lower layers, this technique was able to detect the three fluids on the upper layer of all pads, showing that bodily fluids are distributed within all layers. Additionally, mixtures of these bodily fluids prepared on superabsorbent pads and cotton fabric substrates were studied, since real forensic investigations involving sexual assault cases usually deal with mixtures of different fluid types. Due to their IR marked protein region (1800 – 1480 cm-1), semen and vaginal fluid were easily distinguished from urine. However, since semen and vaginal fluid have both a high protein composition, the region of their IR signatures was quite similar, except for slight visual differences.
In order to differentiate bodily fluids without damaging the sample, the infrared spectra of fluids coming from sexual evidence was correlated with those previously recorded from undamaged stains of individual bodily fluids. With the definition of different thresholds, this method could be applied to an initial screening to collect all stains containing semen; and afterwards, it could be used to perform a more accurate discrimination of the stains with higher concentration of semen. In this way, the forensic practitioner would be able to select the best samples for posterior extraction of DNA prior to the genetic profiling in an attempt to identify the perpetrator. The described method provides qualitative and reliable results, without requiring human interpretation. Therefore, the proposed method opens a door for a low-cost, fully automated and efficient system for non-destructive screening of semen, which could be easily and massively implemented.
On the other hand, in Chapter 2, an extraction protocol from the lower core and the other layers of superabsorbent polymer (SAP) sanitary pads was developed for semen analysis. The current procedure for extracting this bodily fluid from the pads consists in the incubation with water of the SAPs-free upper layers. Besides, there were no studies of efficiency regarding the recapture of semen from the different layers, and a real quantitative assessment was necessary in this respect. Therefore, the subchapter 2.1 was the first approach to characterise different superabsorbent sanitary pads and to assess the efficiency of semen recovery from their SAPs-free layers. Semen was detected up to 1:25000 dilutions for all substrates in the upper layers with maximum yields of 8% for male cell DNA and 4% for sperm cells quantifications.
A simulation of the lower-absorbent core was performed creating sodium polyacrylate hydrogels embedded with semen. Different chemical treatments followed by filtration with nylon and polyester (PETE) membranes installed in NAO® Baskets allowed the extraction of semen from the hydrogels. The 100% isopropanol incubation presented the highest sperm cell recovery (6.0%).
Previous results showed a need to develop and optimise the protocol for semen extraction from the lower core, in contrast with the common procedure that only considers the upper layers. Thus, a follow-up study was performed to analyse the efficiency of different chemical and physical treatments to extract semen from the lower core of pads. The lower core is usually composed of sodium polyacrylate SAPs. SAPs generate a hydrogel that retains bodily fluids, hindering the possibility of obtaining cells and hence their genetic material. A comparison of both chemical and physical shredding treatments was studied for maximising sperm and male cell DNA recovery from superabsorbent substrates, as sanitary napkins, panty-liners or diapers. With different treatments, it was possible to obtain genetic profiles from the solution extracted from the lower core of pads, without chemical or SAPs interference. Entire sections of the substrates incubated with different solutions obtained enhanced sperm and male cell DNA recaptures than when just eluting the upper layers of the pads. From the present Thesis, it is recommended to induce a dewaterisation of the hydrogels in order to maximise the extraction of bodily fluids. Despite the crucial impact these types of evidence might have in sexual assault cases, due to their capability of retain bodily fluids and thus maintain the integrity of DNA, there are a low number of published studies focused on optimizing the elution of bodily fluids from superabsorbent sanitary pads.
