Generational effects of priority emerging pollutants

• Autores: Susana Andreia Teixeira de Barros
• Directores de la Tesis: Ana María Coimbra (dir. tes.), Teresa Neuparth (codir. tes.), José Benito Quintana Álvarez (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro ( Portugal ) en 2024
• Idioma: inglés
• Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco Manuel Pereira Peixoto (voc.), Ana Maria Ferreira Capitão (voc.), Davide Degli Esposti (voc.), Isabel Maria Cunha Antunes Lopes (voc.), António Paulo Alves Ferreira de Carvalho (voc.)
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• Resumen
  • English

    Aquatic ecosystems are continually facing pressures imposed by human activities, particularly those associated with chemical contamination. In recent years, the scientific community has become increasingly interested on the environmental impacts of pharmaceutically active compounds (PhACs) as contaminants of emerging concern. This interest resulted from the potent bioactivity of these compounds even at very low concentrations, as well as, the development of highly sensitive analytical techniques that have improved detection of PhACs in environmental samples worldwide. Therefore, although their low environmental concentrations were previously believed to pose little or no threat to non-target organisms, PhACs are now recognized for their long-term environmental concern.

    Despite the growing number of studies evaluating the short-term effects of PhACs, there is an urgent need to improve the methodologies commonly used. Short-term bioassays, mostly using high concentrations of PhACs, have limited environmental relevance.

    Consequently, current toxicity testing often underestimates the potential threats posed by PhACs to living organisms. Given that natural populations are continuously exposed to low concentrations of PhACs throughout their entire life-cycles, the use of long-term bioassays is crucial to achieve a more realistic evaluation of the associated risks. Unfortunately, this kind of data is frequently unavailable for PhACs. However, this type of test approach would allow to investigate a fundamental aspect of PhACs, as bioactive compounds, namely their mode of action (MoA) in non-target organisms. Furthermore, by using multi-parametric analyses that span multiple levels of biological organization, it is possible to assess the signaling pathways affected by long-tern exposures to PhACs and to establish links between their MoA with the effects observed at the apical level.

    To address this need, the current thesis focused on the effects of three widely-used PhACs commonly detected in surface waters: simvastatin (SIM), metformin (MET), and naproxen (NPX), using zebrafish as a model organism. A partial life-cycle exposure with SIM and generational exposures with NPX and MET (a full generational exposure and inter-generational exposure, respectively) were conducted using environmentally relevant concentrations of each PhAC. Different developmental phases of zebrafish were evaluated, using a multidisciplinary approach that enabled the assessment of several levels of biological organization. Gene expression (qRT-PCR and RNA-seq), biomarkers of lipid content (cholesterol and triglycerides), histopathology, survival, growth and reproductive output were assessed. Together, these analyses allowed for a better evaluation of the PhACs bioactive nature by linking key biological responses with their MoA.

    In this thesis, valuable data is provided to fill the existing gaps on the long-term effects of these PhACs. It was determined that, even at environmental concentrations, SIM, MET and NPX consistently induced important adverse effects on zebrafish (Danio rerio) across several biological functions, including lipid/carbohydrate homeostasis, brain and liver energy metabolism, growth and reproduction. Furthermore, the molecular analyses performed provided compelling evidence that MET and NPX may act as endocrine disrupting chemicals (EDCs) by interfering with steroid hormone biosynthesis at concentrations in the range of the ng/L. The RNA-seq analysis performed also indicated disruption of zebrafish epigenetic machinery, suggesting that exposure to these PhACs may have deep impacts on population structure across generations. Lastly, non-monotonic dose-response curves (NMDRC) were frequently observed in this research which challenge the conventional understanding of dose-response relationships. Therefore, it is crucial to conduct long-term bioassays with environmental concentrations of PhACs to determine safe levels of exposure.

    Notably, none of the studies presented in this thesis were able to determine a No-Observed Effect Concentration (NOEC) for the selected PhACs, as all of the lowest concentrations tested (8 ng/L for SIM, 390 ng/L for MET, and 100 ng/L for NPX) negatively affected zebrafish, even at apical level. In fact, the environmentally relevant concentrations of the PhACs here analyzed, which induced noteworthy adverse effects, are several orders of magnitude lower than the current predicted no-effect concentrations (PNEC) and environmental quality standards (EQS) used in environmental risk assessment for these PhACs. Thus, this thesis results show that the toxicological risks of the selected PhACs may have been underestimated, and suggest that their current PNECs/EQS should be revised.

    Together these findings highlight the need for long-term assessments, especially in the context of generational and/or multi/trans-generational effects, focusing on environmentally relevant concentrations of PhACs. This approach is crucial to accurately evaluate the effects on non-target organisms and the extent of toxicological risks to aquatic ecosystems. It is therefore proposed that regulatory agencies give priority to long-term toxicity assessment strategies by establishing appropriate test guidelines for PhACs, to ensure an accurate assessment of their impacts on ecosystems under more realistic scenarios.

  • português

    Os ecossistemas aquáticos enfrentam continuamente pressões impostas pelas atividades humanas, em especial as associadas à contaminação química. Nos últimos anos, a comunidade científica tem vindo a ganhar cada vez mais interesse pelos compostos farmacologicamente ativos (PhAC) como contaminantes de preocupação emergente. Este interesse resulta da potente bioatividade destes compostos, mesmo em concentrações extremamente baixas, bem como do desenvolvimento de técnicas analíticas altamente sensíveis que permitiram uma melhor deteção de PhACs em amostras ambientais em todo o mundo. Por conseguinte, embora se acreditasse anteriormente que as suas baixas concentrações ambientais constituíam uma ameaça reduzida para os organismos não-alvo, os PhACs são agora reconhecidos pela sua preocupação ambiental a longo prazo.

    Apesar do número crescente de estudos que avaliam os efeitos a curto prazo dos PhACs, há uma necessidade urgente de melhorar as metodologias habitualmente utilizadas na área da toxicologia ambiental. Os bioensaios a curto prazo, que utilizam maioritariamente concentrações elevadas de PhACs, têm uma relevância ambiental limitada.

    Consequentemente, estes ensaios ecotoxicológicos frequentemente subestimam as potenciais ameaças que os PhAC representam para os organismos vivos. Dado que as populações naturais estão continuamente expostas a baixas concentrações de PhACs ao longo de todo o seu ciclo de vida, a utilização de bioensaios a longo prazo é crucial para obter uma avaliação mais realista do risco associado. No entanto, na maioria dos casos, este tipo de dados não está disponível para os PhAC. Contudo, Os bioensaios a longo prazo permitem investigar um aspeto fundamental dos PhACs, enquanto compostos bioativos, nomeadamente o seu modo de ação (MoA) em organismos não-alvo. Além disso, ao utilizar análises multiparamétricas que abrangem vários níveis de organização biológica, é possível avaliar as vias de sinalização afetadas por exposições prolongadas a este tipo de compostos e estabelecer ligações entre o seu MoA e os efeitos observados a nível apical.

    Para dar resposta a esta necessidade, esta tese centrou-se nos efeitos de três fármacos amplamente utilizados e frequentemente detetados em águas superficiais:

    sinvastatina (SIM), metformina (MET) e naproxeno (NPX), utilizando o peixe-zebra (Danio rerio) como organismo modelo. Foi efetuada uma exposição de ciclo de vida parcial com SIM e exposições geracionais com NPX e MET (uma exposição geracional completa e uma exposição intergeracional, respetivamente) utilizando concentrações ambientalmente relevantes de cada PhAC. Foram avaliadas diferentes fases de desenvolvimento do peixe-zebra, utilizando uma abordagem multidisciplinar que permitiu a avaliação de vários níveis de organização biológica. Avaliaram-se a expressão génica (qRT-PCR e RNA-seq), biomarcadores do conteúdo lipídico (colesterol e triglicéridos), histopatologia, sobrevivênciacrescimento e capacidade reprodutiva. Em conjunto, estas análises permitiram realizar uma melhor avaliação da natureza bioativa dos PhACs estudados, ligando as principais respostas biológicas ao seu MoA.

    Nesta tese, são fornecidos dados valiosos para preencher as lacunas existentes sobre os efeitos a longo prazo destes PhACs. Foi determinado que, mesmo em concentrações ambientalmente relevantes, os PhACs SIM, MET e NPX induziram consistentemente efeitos adversos em várias funções biológicas do peixe-zebra, incluindo a homeostase dos lípidos/carboidratos, metabolismo energético do cérebro e fígado, crescimento e reprodução.

    Além disso, as análises moleculares efetuadas forneceram evidências de que a MET e o NPX podem atuar como disruptores endócrinos (EDCs), interferindo com a biossíntese de hormonas esteroides, a concentrações da ordem dos ng/L. A análise de RNA-seq realizada também indicou a perturbação da maquinaria epigenética do peixe-zebra, sugerindo que a exposição a estes PhACs pode ter impactos profundos na estrutura da população ao longo das gerações. Por último, foram frequentemente observadas curvas dose-resposta nãomonotónicas (NMDRC), algo que desafia as relações dose-resposta convencionais em ecotoxicologia. Por conseguinte, é crucial efetuar bioensaios a longo prazo com concentrações ambientais de PhACs para determinar níveis seguros de exposição.

    Curiosamente, nenhum dos estudos apresentados nesta tese foi capaz de determinar uma Concentração de Efeito Não Observado (NOEC) para os PhACs selecionados, uma vez que todas as concentrações mais baixas testadas (8 ng/L para SIM, 390 ng/L para MET e 100 ng/L para NPX) afetaram negativamente o peixe-zebra, mesmo ao nível apical. De facto, as concentrações ambientalmente relevantes dos PhACs aqui analisados, que induziram efeitos adversos dignos de nota, são várias ordens de grandeza inferiores às atuais concentrações sem efeitos previsto (PNEC) e às normas de qualidade ambiental (EQS) utilizadas na avaliação dos riscos ambientais para estes PhACs. Assim, os resultados desta tese mostram que os riscos toxicológicos dos PhACs selecionados podem ser subestimados se se usarem os PNECs/EQS atuais pelo que se sugere a sua revisão.

    Em conjunto, estas conclusões sublinham a necessidade de efetuar avaliações a longo prazo, especialmente no contexto de efeitos geracionais e/ou multi/transgeracionais, centradas em concentrações ambientalmente relevantes de PhACs. Esta abordagem é crucial para avaliar com maior exatidão os efeitos nos organismos não-alvo e a extensão dos riscos toxicológicos para os ecossistemas aquáticos. Propõe-se, por conseguinte, que as agências reguladoras privilegiem estratégias de avaliação da toxicidade a longo prazo, estabelecendo regulamentos para a realização de ensaios biológicos adequados para os PhACs, a fim de garantir uma avaliação dos seus impactos nos ecossistemas considerando cenários mais realistas.