Search for new genes, molecular mechanisms and diagnostic tools in postlingual hereditary hearing loss
- Autores: María Lachgar Ruiz
- Directores de la Tesis: Miguel Ángel Moreno Pelayo (dir. tes.), Karen Steel (dir. tes.), Matias Morín Rodriguez (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Complutense de Madrid ( España ) en 2023
- Idioma: inglés
- Títulos paralelos:
- Búsqueda de nuevos genes, mecanismos moleculares y abordajes diagnósticos en hipoacusias hereditarias postlocutivas
- Tribunal Calificador de la Tesis: Eva de Lago Femia (presid.), F. Carricondo (secret.), Álvaro Gallego Martínez (voc.), Karen Avraham (voc.), Isabel Varela Nieto (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Bioquímica, Biología Molecular y Biomedicina por la Universidad Complutense de Madrid
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Docta Complutense
- Resumen
- español
Las hipoacusias neurosensoriales no sindrómicas son el trastorno sensorial más común y son genéticamente heterogéneas. La identificación de nuevos genes y variantes asociados a hipoacusia avanza rápidamente, por lo que el uso de herramientas de secuenciación masiva (NGS) es esencial para realizar un diagnóstico genético.
En este trabajo, hemos utilizado OTO-NGS-panel V2, un panel de NGS diseñado por nuestro grupo que contiene 117 genes asociados a hipoacusias para estudiar el espectro mutacional de las hipoacusias no sindrómicas de herencia autosómica dominante (AD) en la población española. OTO-NGS-panel V2 fue validado para la identificación de mutaciones puntuales, pequeñas inserciones y deleciones y variaciones del número de copias. Con esta herramienta, se analizaron 108 familias con hipoacusia no sindrómica e identificamos la variante causal en 39 casos, lo que constituye una tasa diagnóstica del 36,11%. Los genes con mayor prevalencia son WFS1 (7,41 %), seguido de MYO7A (5,56 %), MYO6 (4,63 %), TECTA (2,78 %) y ACTG1 (2,78%). Para estudiar los casos no diagnosticados, diseñamos un panel de genes candidatos, que incluye genes asociados a sordera en ratón pero sin mutaciones reportadas en humanos hasta la fecha. Se identificaron variantes candidatas en los genes XIRP2, USP31, PLS1 y KCNK5.
Por otro lado, hemos utilizado modelos celulares y animales para investigar los mecanismos de patogénesis de la hipoacusia asociada a mutaciones en CCDC50 y MIR96, respectivamente.
Identificamos una nueva mutación en CCDC50 (c.828_858del, p.(Asp276Glufs*40)) que segrega con la hipoacusia en una familia española con un patrón de herencia AD. Para estudiar el mecanismo de patogénesis de estas mutaciones, realizamos estudios in vitro utilizando seis mutaciones artificiales y dos mutaciones humanas p.(Asp276Glufs*40) y p.(Phe292Hisfs*37).
Determinamos que solo los mutantes que contienen la secuencia de 6 aminoácidos CLENGL en su cola proteica aberrante muestran una distribución anormal que consiste en agregados perinucleares de Ymer, la proteína codificada por CCDC50. Por lo tanto, concluimos que la secuencia CLENGL es necesaria para formar los agregados de Ymer. Estos resultados, junto con nos umbrales auditivos normales en ratones con pérdida de función de Ccdc50 (Ccdc50tm1a y Ccdc50tm1b), sugieren que las dos mutaciones humanas en CCDC50 ejercen su efecto a través de un mecanismo dominante negativo o de ganancia de función en lugar de haploinsuficiencia.
Por último, investigamos los mecanismos patológicos de hipoacusia asociada a mutaciones en miR-96, un microRNA que actúa como regulador de la transcripción en el oído interno y coordina la maduración de las células ciliadas. Se ha descrito que mutaciones puntuales en la región semilla de miR-96 causan pérdida auditiva progresiva de herencia AD en humanos y ratones. En este trabajo, presentamos dos modelos de ratón que portan dos mutaciones puntuales causantes de hipoacusia progresiva en humanos (Mir96s403 y Mir96s1334). Los ratones homocigotos para ambas mutaciones presentan sordera profunda, los ratones Mir96s1334 heterocigotos tienen una pérdida auditiva progresiva leve, pero los Mir96s403 heterocigotos tienen una audición normal. Los ratones Mir96s403 homocigotos tienen una reducción en el número de sinapsis de las células ciliadas internas a las cuatro semanas de edad. Además, secuenciación del RNA (RNA-seq) del órgano de Corti de ratones de 4 días de edad mostró que los ratones Mir96s1334 homocigotos tienen un mayor número de genes diferencialmente expresados que los Mir96s403 homocigotos, lo que se correlaciona con el fenotipo estructural más severo observado en estos mutantes.
En general, esta tesis proporciona información sobre los genes con más mutaciones en una cohorte de familias españolas con hipoacusia neurosensorial y sugiere posibles mecanismos para la pérdida de audición causada por mutaciones en CCDC50 y MIR96.
- English
Non-syndromic sensorineural hearing loss (SNHL) is the most common sensory disorder, and it presents a high genetic heterogeneity. New genes and variants associated with hearing loss are described at a very rapid pace, making the use of next-generation sequencing (NGS) approaches essential to undertake a genetic diagnosis. We have used OTO-NGS-panel V2, a custom-designed NGS panel containing 117 genes associated with hearing loss to study the mutational spectrum of autosomal dominant non-syndromic hearing loss in the Spanish clinical population. OTO-NGS-panel V2 was validated for the identification of single nucleotide variants (SNVs), small insertions and deletions (Indels) and copy number variations (CNVs), and 108 Spanish families with autosomal dominant non-syndromic hearing loss (ADNSHL) were analysed. We identified the causative variant in 39 cases, constituting a diagnostic rate of 36.11%. The genes with the highest prevalence are WFS1 (7.41%) followed by MYO7A (5.56%), MYO6 (4.63%), TECTA (2.78%) and ACTG1 (2.78%). To identify the genetic cause of deafness in the cases that remained undiagnosed upon analysis with OTO-NGS-panel V2, we designed a candidate gene panel, including genes known to cause deafness in mice but with no human mutations reported so far. Candidate variants were found in the genes XIRP2, USP31, PLS1 and KCNK5. Furthermore, we have used cellular and animal models to investigate the pathogenic mechanisms of hearing loss due to mutations in CCDC50 and MIR96, respectively. As part of our clinical genetic studies, we ascertained a novel mutation in CCDC50 (c.828_858del, p.(Asp276Glufs*40)) segregating with the hearing impairment in a Spanish family with autosomal dominant SNHL that is predicted to disrupt the protein function. To gain insight into the mechanism behind CCDC50 mutations, we carried out in vitro studies on a set of artificial mutants and on the p.(Asp276Glufs*40) and p.(Phe292Hisfs*37) human mutations and determined that only the mutants containing the six amino acid sequence CLENGL as part of their aberrant protein tail showed an abnormal distribution consisting of perinuclear aggregates of the CCDC50-encoded protein Ymer. Therefore, we conclude that the CLENGL sequence is necessary to form the aggregates. These results, together with the normal hearing thresholds in Ccdc50 loss-of-function mouse mutants (Ccdc50tm1a and Ccdc50tm1b), suggest that the two human mutations in CCDC50 exert their effect through a dominant-negative or gain-offunction mechanism rather than by haploinsufficiency. Finally, we wanted to investigate the underlying pathological mechanisms of mutations in miR-96, which is important for hearing since it acts as a transcriptional regulator in the inner ear and coordinates hair cell maturation. Point mutations in the seed region of miR-96 cause dominant progressive hearing loss in humans and mice. Here, we present two mouse mutants carrying two point mutations identified as underlying progressive hearing loss in humans (Mir96s403 and Mir96s1334). Homozygotes of both mouse lines exhibit profound hearing loss, Mir96s1334 heterozygous mice have mild progressive hearing loss, but Mir96s403 heterozygotes have normal hearing in contrast to humans carrying this mutation. Structural analyses showed hair cell degeneration and misshapen hair bundles in both mutants, with Mir96s1334 mice being more severely affected. Our new results indicate that Mir96s403 homozygotes have a reduction in the number of inner hair cell ribbon synapses at four weeks old. Furthermore, bulk RNA-seq of the organ of Corti of 4-days-old mice showed that Mir96s1334 homozygous mice have a larger number of differentially-expressed genes than Mir96s403 homozygotes, which correlates with the more severe structural phenotype observed in these mutants. Sylamer analysis suggests that the phenotype of Mir96s403 and Mir96s1334 mutants is a combination of the lack of repression of normal targets and the gain of repression of novel targets. Ocm and Slc26a5 are strongly downregulated in Mir96s403 and Mir96s1334 mutant mice, but neither has a predicted wildtype or mutant miR-96 target site, suggesting that their downregulation is a downstream effect. To determine whether these genes regulate each other in the miR-96 regulatory network, we studied the effect of knocking down each of the genes in mice on the expression of the other gene by using Ocmtm1e and Slc26a5tm1Cre mutant mice. We used RT-qPCR to investigate the inner ear of 5-days-old and 10-weeks-old mice. The mRNA levels of Slc26a5 were unaffected in Ocmtm1e homozygotes, and Ocm levels were unaffected in Slc26a5tm1Cre homozygotes. Our findings indicate that it is unlikely that oncomodulin regulates prestin, or vice versa. Overall, this thesis provides insights into the genes with more mutations in a cohort of Spanish families with SNHL and suggests possible mechanisms for hearing loss caused by mutations in CCDC50 and MIR96.
- español
