Resumen de Caracterización de la familia génica de las nucleosidasas en phaseolus vulgaris
1. Introducción o motivación de la tesis: Los nucleótidos son moléculas de vital importancia en todos los seres vivos, ya que, además de ser componentes esenciales de los ácidos nucleicos, participan en procesos bioenergéticos, forman parte de cofactores de enzimas y de segundos mensajeros, y son precursores para la síntesis de metabolitos primarios y secundarios.
En plantas, los nucleótidos de purina y de pirimidina pueden proceder de la síntesis de novo, el reciclado de nucleósidos y bases nitrogenadas o pueden absorberse directamente del suelo.
Como en la mayoría de animales y microorganismos, el catabolismo de pirimidinas en plantas conlleva la reducción de uracilo y timina hasta CO2, NH3 y ß-alanina o ß -aminoisobutirato, respectivamente. En cuanto al catabolismo de purinas, las plantas pueden oxidarlas completamente y recuperar el nitrógeno presente en ellas, mientras que la mayoría de los animales no. Otra particularidad del metabolismo de purinas en plantas es su relevancia en las leguminosas ureídicas, ya que la nucleobase xantina es el precursor de los ureidos alantoína y alantoato, moléculas claves en el transporte y almacenamiento de nitrógeno en este grupo de leguminosas. Además, en los últimos años se ha sugerido una conexión importante entre el catabolismo de los ácidos nucleicos y nucleótidos y el de ureidos en distintos procesos en los que se produce una elevada movilización de nitrógeno.
Tanto las rutas de síntesis de novo como las de reciclaje de nucleótidos confluyen en la formación de nucleótidos monofosfato, que son los sustratos de las 5¿-nucleotidasas, fosfatasas que catalizan el primer paso de la ruta de degradación. Un elemento clave en la ruta de degradación de purinas es la formación del nucleósido xantosina, ya que marca un punto de no retorno en la degradación de purinas, pues no puede ser reciclada. El siguiente paso en la ruta de degradación de purinas y pirimidinas lo catalizan las nucleosidasas (nucleósido hidrolasas, NSH), enzimas que hidrolizan los nucleósidos hasta la base nitrogenada y ribosa, y que se han postulado como enzimas clave en el control del equilibrio entre degradación y reciclaje de nucleótidos.
Las nucleosidasas también pueden jugar un papel importante en procesos de señalización, ya que para que el eATP, una molécula señalizadora extracelular, actúe de manera eficiente, debe de poder ser retirado del apoplasto una vez ejerza su función, lo que ocurre por la acción concertada de apirasas y nucleotidasas y nucleosidasas extracelulares. Estas nucleosidasas también podrían participar en la recuperación de nucleósidos del suelo o los que son liberados cuando una célula se daña.
2.Contenido de la investigación: El objetivo principal de este trabajo ha sido la caracterización de la familia génica de las nucleosidasas en la leguminosa ureídica Phaseolus vulgaris. Para ello, se han clonado los genes que codifican dichas enzimas en judía, lo que ha permitido determinar que dicha familia está formada por, al menos, cuatro genes, dos de localización citosólica (PvNSH1 y PvNSH2) y dos de localización apoplástica (PvNSH3 y PvNSH4). Además, los ORFs de dichos genes se han sobreexpresado en sistemas heterólogos, lo que ha posibilitado la purificación de las enzimas correspondientes y su posterior caracterización. PvNSH1 presenta alta afinidad por nucleósidos de purina y pirimidina, mientras que PvNSH2 parece más específica de purinas y, en particular, de xantosina. En cuanto a las nucleosidasas apoplásticas, PvNSH4 es activa a pH ácido y utiliza, principalmente, inosina como sustrato, mientras que no se ha podido caracterizar la actividad de PvNSH3. Cabe destacar, que el análisis filogenético de las nucleosidasas apoplásticas sugiere que estas enzimas tienen un origen evolutivo relativamente reciente, ya que sólo se han identificado en algunos grupos de plantas, pero no en organismos pertenecientes a otros reinos.
Por otro lado, se ha investigado el papel fisiológico de las nucleosidasas en judía. Los resultados obtenidos muestran que PvNSH1 y PvNSH2 juegan un papel relevante durante la germinación y el desarrollo postgerminativo de judía, lo que resalta la importancia del metabolismo de nucleótidos en esta fase de desarrollo. Además, se ha puesto de manifiesto la importancia de estas enzimas en los nódulos de judía, en los que su expresión y actividad es muy elevada, aunque no se ha podido demostrar una relación entre sus niveles y los de ureidos ni en raíces ni en nódulos. En cuanto a las nucleosidasas con posible localización apoplástica, se ha demostrado esta ubicación celular y que PvNSH4 podría estar implicada en situaciones de respuesta a estrés y, en concreto, en aquellas que están mediadas por la hormona metil jasmonato. Por otro lado, no se ha podido obtener información acerca de la función de PvNSH3, ya que se han detectado niveles de expresión muy reducidos y sin cambios significativos en ninguna de las situaciones estudiadas.
