Análisis de los perfiles de expresión de miARN y caracterización funcional en individuos VIH-positivos con distinta progresión a SIDA
- Autores: Rubén Antonio Ayala Suárez
- Directores de la Tesis: José Alcamí Pertejo (dir. tes.), Francisco Díez Fuertes (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Alcalá ( España ) en 2023
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Asier Sáez Cirión (presid.), Santiago Moreno Guillén (secret.), Amanda Fernández Rodríguez (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Funcional y Biotecnología por la Universidad de Alcalá
- Materias:
- Enlaces
- Resumen
- español
Los controladores de élite (EC) y la no progresión a largo plazo (LTNP) representan fenotipos de respuesta beneficiosos en la infección por VIH. Los primeros hacen referencia a personas que mantienen cargas virales indetectables en sangre a pesar de no recibir tratamiento antirretroviral (TAR), mientras que los segundos son capaces de mantener su recuento de células T CD4+ en ausencia de TAR durante largos periodos de tiempo y presentan una progresión mucho más lenta a SIDA. La presencia de determinados factores virológicos, genéticos o inmunológicos pueden contribuir a esta respuesta y el estudio de distintas cohortes apuntan a que estos fenotipos son heterogéneos y determinados de forma multifactorial.
El objetivo principal de la Tesis persigue describir el perfil de expresión de microRNA (miRNA) en el sistema inmunitario de EC y LTNP. Los miRNA son moléculas pequeñas de ARN que tienen un papel importante en la regulación de la expresión génica y pueden modular la expresión de genes del hospedador necesarios para la infección y el ciclo de replicación viral. Un perfil de expresión característico de miRNA en estas respuestas a la infección podrían ayudar a la comprensión del origen de estos fenotipos y generar oportunidades terapéuticas, de diagnóstico y pronóstico en la infección por VIH.
En base a estas premisas en la primera parte de la Tesis Doctoral se ha estudiado el perfil de expresión del miRNoma en las células PBMC de EC-LTNP y LTNP con carga viral detectable. Se han encontrado 14 miRNA diferencialmente expresados asociados al perfil LTNP capaces de regular genes involucrados en la replicación del virus. En el segundo estudio realizado en la Tesis, se ha explorado la asociación de una firma molecular basada en el miRNoma y transcriptoma de las células T CD4+ con los pacientes EC. La motivación de estudiar la implicación de los miRNA en las células T CD4+ radica en su papel como principal diana del VIH. Los EC presentan una represión de 5 miRNA asociados a la sobreexpresión de un conjunto de genes, generando un paisaje transcripcional que facilita el control de la replicación y la destrucción de células infectadas. Para completar este estudio, se evaluó la actividad antiviral de los miR-99b-5p y miR-125a-5p mediante ensayos funcionales, mostrando que su represión dificulta la producción viral in vitro.
En resumen, esta tesis se enfoca en el estudio del perfil de expresión de miRNA en pacientes con infección por VIH, específicamente en los pacientes EC-LTNP y LTNP virémicos. Se espera que los resultados obtenidos permitan identificar mecanismos moleculares implicados en la progresión de la enfermedad y en la capacidad de algunos pacientes para controlar la infección sin tratamiento antirretroviral. Además, se espera que la identificación de miRNA con actividad antiviral permita el desarrollo de nuevas terapias para el tratamiento de la infección por VIH.
- English
About 1% of people living with HIV (PLWH) are elite controllers (EC), competent to maintain their viral load below 50 copies of viral RNA/ml for long periods of time in the absence of antiretroviral therapy (ART). On the other hand, long-term non-progressors (LTNP) are able to maintain CD4+ T-cell numbers above 500 cells/µL for more than 10 years without ART and represent less than 5% of PLWH.
Both phenotypes in combination (EC-LTNP) represent an excellent natural model for functional cure of HIV infection. Although several factors involved in long-term non-progression and natural control have been described, the role of miRNA has not been investigated in depth. The first objective of this work is to study the miRNome of PLWH with extreme phenotypes and to identify biological processes potentially altered by differentially expressed (DE) miRNA. The miRNome was obtained by next-gen sequencing (miRNA-Seq) of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from EC-LTNP, viremic LTNP (<10,000 cp/ml) and PLWH with a typical progression profile (TP). Upon analysis, repression of miR-144-3p, miR-486-3p and miR-3607-5p has been associated with the EC-LTNP phenotype compared to TP with suppressed viral load under ART. In addition, 14 miRNA differentiate LTNP from TP. Four of these miRNA (miR-144-3p, miR-18a-5p, miR-451a, and miR-324) are strongly downregulated in LTNP and regulate the expression of AKT, mTOR, ERK, and IκK, genes involved in the immune response. Subsequently, the second objective of this Thesis is to identify a molecular signature based on the miRNome and transcriptome of CD4+ T cells from EC. In addition, the regulatory role of DE miRNAs on gene expression and the evaluation of miRNA antiviral activity by functional assays are studied. Transcriptome and miRNome, in addition to other non-coding small RNAs (sncRNA), were obtained by RNA-Seq of CD4+ T cells from EC, viremic controllers (<4,000 cp/ml), and non-controllers off (NT) and on ART (ART). The miRNA, mRNA and other sncRNA associated with the natural control of HIV infection, as well as the main pathways and biological terms altered in this phenotype have been studied by differential expression analysis and modeling with Projections on Latent Structures (PLS) using Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) and Overrepresentation Analysis of DE Genes (ORA). The miR-99b-5p and miR-125a-5p were downregulated in EC compared to the ART group. In contrast, comparing EC versus NTs, overexpression of miR-27a-5p has been described along with the attenuation in the expression of miRNAs, including miR-99b-5p and miR-125a-5p. We searched for the DE miRNA gene targets with reverse differential expression and constructed regulatory networks, revealing that targets of miR99b-5p (TIMP2, MAFB, MMP9, DUSP1, or CCL3) and miR-125a-5p (LAMP1, CDKN1A, NBEAL2, BBC3, CSRNP1, SOD2) participate in p53 signaling pathways, the phagosome machinery, or reactive oxygen species production. In addition, the transcriptome of CD4+ T cells from EC shows increased cellular activation and inflammatory response, as well as increased oxidative stress buffering capacity and decreased expression of genes containing KRAB and C2H2 motifs associated with Zinc fingers.
Treatment with miR-99b and miR-125a-5p inhibitors in vitro decreased HIV-1 viral production. The results presented in this Thesis indicate that miRNA have an antiviral role in the natural control of HIV infection and long-term progression to AIDS and although they are not on their own fully responsibles for the development of these phenotypes, they are key players in the modulation of the transcriptional landscape of cells, helping to the maintenance of the CD4+ T cell count and hindering virus replication. The study of their gene targets and the metabolic and signaling pathways affected by them may provide new therapeutic and monitoring opportunities for their use in the clinical setting.
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