Streptococcus suis: caracterización fenotípica y molecular de aislados y desarrollo de una nueva vacuna recombinante
- Autores: Máximo Petrocchi Rilo
- Directores de la Tesis: César B. Gutiérrez Martín (dir. tes.), Sonia Martínez Martínez (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de León ( España ) en 2023
- Idioma: español
- Número de páginas: 301
- Títulos paralelos:
- Streptococcus suis: phenotypic and molecular characterization of isolates and development of a new recombinant vaccine
- Tribunal Calificador de la Tesis: Ma. de los Ángeles Calvo Torras (presid.), Ana María Carvajal Urueña (secret.), Ana Isabel Vela Alonso (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Ciencias Veterinarias y de los Alimentos por la Universidad de León
- Materias:
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- Resumen
- español
Actualmente, las enfermedades respiratorias son uno de los problemas más relevantes en la industria porcina. La preocupación principal proviene del Complejo Respiratorio Porcino (CRP), término acuñado para describir los procesos de neumonía de etiología viral y bacteriana desarrollados en cerdos entre las 16 y 20 semanas de edad. Algunos de los agentes más relevantes en este grupo incluyen el Virus del Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRSV), Glaesserella parasuis, Pasteurella multocida y Streptococcus suis. Junto con estos microorganismos, los factores no infecciosos (como el manejo de los animales y el control de los factores ambientales) contribuyen de forma decisiva a las enfermedades respiratorias, aumentando la diseminación de patógenos y creando condiciones desfavorables que producen estrés de los animales.
En aspecto, S. suis es uno de los principales patógenos de la industria porcina. Esta bacteria Gram-positiva reside de forma asintomática en el tracto respiratorio superior, el intestino y los genitales de los cerdos como parte de su microbiota. La colonización por S. suis ocurre típicamente a través del contacto con la madre y entre los propios lechones durante y después del parto. Sin embargo, puede volverse patógeno cuando penetra a través de barreras mucosas. Una vez pasa estas barreras, la bacteria ingresa al torrente sanguíneo. En este punto, la cápsula de polisacáridos de S. suis permite la protección frente a la fagocitosis y la muerte mediada por monocitos y macrófagos. Por lo tanto, la bacteria puede sobrevivir en la sangre y diseminarse a través el sistema nervioso central y otros órganos del hospedador, causando cuadros clínicos que incluyen meningitis, septicemia, artritis, endocarditis, septicemia o muerte súbita en cerdos enfermos.
Actualmente, el método de clasificación más común de la bacteria se basa en los antígenos de su superficie celular, lo que permite la detección de 29 serotipos. El serotipo más prevalente a nivel mundial es el serotipo 2, mientras que en Europa los serotipos 2 y 9 son los más prevalentes y tienden a ser los más virulentos. Sin embargo, los recientes avances en la tipificación de secuencias multilocus (MLST) han permitido clasificar las cepas de S. suis según su tipo de secuencia, detectando hasta 616 tipos de secuencia, de los cuales el 61 % pertenecen a serotipos específicos. En este sentido, esta Tesis Doctoral abordó el análisis de la distribución de serotipos de 909 aislados de S. suis de diferentes Comunidades Autónomas de España. Los serotipos más comunes entre los aislamientos fueron, en orden descendente, 9, 1-14, 2-1/2, 7, 3 y 8.
Además, se detectaron por PCR los genes epf, mrp, sly, gapdh y luxS en 909 aislados, ya que su estudio puede proporcionar información útil sobre el perfil de virulencia de las cepas. Los factores de virulencia más detectados fueron, en orden decreciente, luxS, mrp, gapdh, sly y mrp. El patrón de virulencia más observado fue el patrón epf + /mrp + /sly + /luxS + /gapdh +. Además, se determinó si existía asociación entre aislados pertenecientes a los diferentes serotipos y la expresión de marcadores de virulencia específicos. Los análisis estadísticos dieron lugar a tres asociaciones estadísticamente significativas. La asociación más fuerte fue la correlación entre aislados pertenecientes a uno de los serotipos más significativos, con que su perfil de virulencia incluyera el patrón epf + /mrp + /sly +, con un valor p inferior a 0,0001.
Por otro lado, en cuanto a la alta variabilidad entre las cepas de S. suis, los diferentes tipos de secuencias y serotipos son las principales dificultades para desarrollar una formulación vacunal eficaz que pueda proporcionar una protección amplia y duradera. Además, la bacteria puede evadir el sistema inmunológico del hospedador y sobrevivir dentro de este. Esta capacidad hace que la tarea de desarrollar una vacuna universal sea aún más difícil. Aunque muchos estudios han intentado desarrollar vacunas frente a S. suis, no se ha encontrado una solución completamente efectiva.
Una vacuna eficaz debería poder estimular una respuesta inmunitaria que permita reconocer y neutralizar todas las variantes de la bacteria. Por ello, en esta Tesis Doctoral se eligieron dos proteínas altamente conservadas como candidatos vacunales para tratar de conseguir una protección completa y potencialmente heteróloga frente a S. suis. A partir de las secuencias de estas proteínas se diseñaron dos proteínas recombinantes, las cuales se obtuvieron mediante protocolos de expresión y purificación de proteínas. Posteriormente, se prepararon tres formulaciones vacunales con el adyuvante correspondiente y se realizó una prueba de inmunización en ratones para evaluar el título de anticuerpos desarrollados por la vacuna.
Tanto la proteína A como la proteína B demostraron ser proteínas capaces de provocar la seroconversión en ratones BALB/c tras su administración intraperitoneal. Sin embargo, no pudieron proteger a los ratones frente al desafío con una cepa virulenta de S. suis del serotipo 2. Asimismo, la proteína A fue más inmunogénica que la proteína B y la combinación de ambas. Sin embargo, las condiciones de prueba experimental en ratones y los protocolos de expresión de proteínas recombinantes deben optimizarse con el fin de permitir una mejor extrapolación de los resultados obtenidos, lograr una mayor eficiencia en los procedimientos realizados y transferir eventualmente la prueba experimental a cerdos.
No obstante, se debe tener en cuenta que, además de la amenaza que representa la bacteria, la resistencia que está desarrollando a los antibióticos, al igual que ocurre con otros patógenos, se está convirtiendo en un problema emergente. De hecho, según un informe de la Organización Mundial de la Salud (OMS) de 2019, alrededor de 2,4 millones de personas podrían morir en los países desarrollados entre 2015 y 2050 en ausencia de un plan estratégico para controlar las resistencias a los antibióticos.
En la presente tesis doctoral, se evaluó la prevalencia de seis genes de resistencia a antibióticos (GRAs), además de la susceptibilidad a dieciocho antibióticos, con el objetivo de determinar el tratamiento más efectivo para la enfermedad causada por S. suis en cerdos. Además, se determinó si existía una asociación entre la presencia de GRAs frente a una familia específica de antibióticos y la resistencia observada a nivel fenotípico cuando el aislado era expuesto a esa familia de antimicrobianos.
Los genes de resistencia más detectados entre los 303 aislamientos estudiados fueron, en orden decreciente, tet(O), erm(B), lsa(E) y lnu(B), tet(M) y mef(A/E). Asimismo, el patrón de resistencia más detectado fue el patrón erm(B) + /mef (A/E) − /tet(M) - /tet(O) + /lsa(E)/lnu(B) −. Por otro lado, en cuanto a la susceptibilidad antimicrobiana, los antibióticos más efectivos para inhibir el crecimiento de S. suis fueron, en orden decreciente, la ampicilina, la gentamicina y el ceftiofur. Asimismo, los antibióticos menos efectivos para inhibir el crecimiento bacteriano fueron la sulfadimetoxina, la clortetraciclina y la oxitetraciclina.
Finalmente, el estudio de la asociación entre la presencia de genes específicos de resistencia a antibióticos (GRAs) y la resistencia observada a nivel fenotípico permitió detectar hasta siete asociaciones estadísticamente significativas. La asociación más fuerte fue la que relacionaba la presencia del gen tet(O) con la resistencia observada a nivel fenotípico para clortetraciclina y oxitetraciclina, con un valor de p inferior a 0,0001.
Por lo tanto, se ha comprobado que los aislados de S. suis utilizados en este estudio cuentan con patrones de AMR preocupantes, ya que las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos mostraron niveles de resistencia muy elevados. Además, los dos candidatos vacunales indujeron efectivamente la seroconversión en ratones BALB/c. Sin embargo, se requerirán protocolos de optimización para mejorar los títulos de IgG obtenidos.
- English
Respiratory diseases are currently one of the most critical health issues in the porcine industry. They are often the result of a combination of primary and opportunistic infectious agents. In pig farming, the main threat comes from the Porcine Respiratory Disease Complex (PRDC), a term coined for describing the viral and bacterial etiology pneumonia processes developed in pigs between 16 and 20 weeks of age. Some of the most relevant agents in this group include the Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV), Glaesserella parasuis, Pasteurella multocida and Streptococcus suis. Along with these microorganisms, non-infectious factors (such as animal handling and controlling environmental factors) contribute decisively to respiratory disease, increasing the dissemination of pathogens and creating unfavorable conditions that lead to stress for the animals.
In these terms, S. suis is one of the main post-weaning pathogens in the porcine industry. This Gram-Positive bacterium resides asymptomatically in the upper respiratory tract, intestine, and genitalia of pigs as part of their microbiota. Colonization by S. suis typically occurs through close contact with the mother and between the piglets themselves during and after farrowing. However, it can become pathogenic when it penetrates the mucosal barrier. Once it passes those barriers, the bacterium enters the bloodstream. At this point, the CPS of S. suis allows protection against phagocytosis and monocyte and macrophage-mediated killing. Hence, the bacteria can survive in blood and spread throughout the central nervous system and other host organs, commonly causing meningitis, septicemia, arthritis, endocarditis, septicemia, or sudden death in diseased pigs.
Currently, the most common classification method of the bacteria is based on the antigens on its cell surface, which allows the detection of 29 serotypes. The most prevalent serotype worldwide is serotype 2, while in Europe, serotypes 2 and 9 are the most prevalent and tend to be the most virulent. However, the recent advances in multilocus sequence typing (MLST) have allowed S. suis strain classification according to their sequence type, detecting up to 616 sequence types, 61 % of which belong to specific serotypes. This Doctoral Thesis addressed the analysis of the serotype distribution of 909 S. suis isolates from different regions of Spain. The most common serotypes among the isolates were, in descending order, 9, 1-14, 2-1/2, 7, 3, and 8.
Furthermore, the PCR detection of virulence determinants was studied, as epf, mrp, sly, gapdh and luxS genes can provide valuable data about the virulence profile of the strains. In this Doctoral Thesis, these five genes were studied in 909 isolates. In decreasing order, the most detected virulence factors among the isolates were luxS, mrp, gapdh, sly and mrp. The most observed virulence pattern was the epf + /mrp + /sly + /luxS + /gapdh + pattern. In addition, it was determined whether there was an association between isolates belonging to the different serotypes and the expression of specific virulence markers. The statistical analyses gave rise to three statistically significant associations. The strongest association was the correlation between isolate belonging to one of the most significant serotypes, with its virulence profile including the epf + / mrp + / sly + pattern, with a p-value less than 0.0001.
On the other hand, concerning the high variability between S. suis strains, different sequence types and serotypes are the main difficulties in developing an effective vaccine formulation which can provide broad and long-lasting protection. Furthermore, the bacterium can evade the host's immune system and survive within the host. This ability makes the task of developing a universal vaccine even more difficult. Although many studies have tried to develop vaccines against S. suis, an utterly effective solution has not been found.
An effective vaccine should be able to stimulate an immune response that can recognize and neutralize all variants of the bacteria. For this reason, in this Doctoral Thesis, two highly conserved proteins were chosen as vaccine candidates to achieve complete and heterologous protection against S. suis. Two recombinant proteins were designed from the sequences of these proteins, which were obtained through protein expression and purification protocols. After that, three vaccine formulations were prepared with the corresponding adjuvant and an immunization test was carried out in mice to assess the titer of antibodies developed by the vaccine.
Both B and A proteins proved to be proteins capable of causing seroconversion in BALB/c mice after intraperitoneal administration. However, they could not protect mice against the challenge of a virulent strain of S. suis serotype 2. Likewise, the A protein was more immunogenic than the B protein and the combination of both. However, the experimental test conditions in mice and the recombinant protein expression protocols should be optimized to allow better extrapolation of the obtained results, achieve greater efficiency in the performed procedures and eventually transfer the experimental test to pigs.
Nevertheless, in addition to the threat posed by the bacterium, the resistance it is developing to antibiotics, like other pathogens, is becoming an emerging problem. In fact, according to a 2019 World Health Organization (WHO) report, around 2.4 million people could die in developed countries between 2015 and 2050 without a strategic plan to control antibiotic resistance.
Specifically, we evaluated the prevalence in our isolates of six antibiotic-resistance genes (ARG) and the susceptibility to eighteen antibiotics to determine the most effective treatment of streptococcal diseases in pigs. In addition, we determined if there was an association between the presence of ARGs against a specific family of antibiotics and the resistance observed at the phenotypic level when the isolate was exposed to that family of antimicrobials.
The most detected resistance genes among the 303 isolates studied were, in decreasing order, tet(O), erm(B), lsa(E) and lnu(B), tet(M) and mef(A/E). Likewise, the most detected resistance pattern was the pattern erm(B) + / mef(A/E) − / tet(M) − / tet(O) + / lsa(E)/lnu(B) −. On the other hand, regarding antimicrobial susceptibility, the most effective antibiotics to inhibit the growth of S. suis were, in decreasing order, ampicillin, gentamicin and ceftiofur. Likewise, the least effective antibiotics to inhibit bacterial growth were sulfadimethoxine, chlortetracycline and oxytetracycline.
Finally, the study of the association between the presence of specific antibiotic resistance genes and the resistance observed at the phenotypic level allowed up to seven statistically significant associations to be detected. The strongest association was the one relating the presence of the tet(O) gene with the resistance observed at the phenotypic level for chlortetracycline and oxytetracycline, with a p-value less than 0.0001.
Therefore, it has been demonstrated that S. suis isolates used in this study exhibited worrisome AMR patterns, as antibiotic susceptibility testing showed overall high resistance levels. Besides, the two vaccinal candidates effectively induced seroconversion in BALB/c mice. However, optimization protocols will be required to enhance the obtained IgG titers.
- español
