Resumen de Función de la proteína U-box phor1 en la integración de las rutas de señalización de giberelinas (GAs) y de defensa frante a patógenos
Juan Manuel Iglesias Pedraz
Abreviaturas. 1 introducción. 4 1.- las giberelinas (gas). 4 1.1.-metabolismo degas. 4 1.1.1.- biosíntesís y catabolismo de gas. 5 1.1.2.- mutantes de biosíntesís de gas. S 1.2.- regulación de los niveles endógenos de gas. 9 1.3.-transporte de gas. 10 1.4.-transduccióndelaseñaldegas. 10 1.4.1.- receptor de gas. 11 1.4.2.- reguladores de la señal de gas. 11 a. Los represores della. 12 b. El complejo scf^''^ en la regulación de la señal de gas. 15 1.4.3.- otras s^ales hormonales implicadas en la regulación de los rqnesores della. 16 2.-el proteasoma26s y sus componentes. 17 2.1.- degradación de proteínas por el sistema proteasoma26s. 18 2.2.- señalización por ubiquitinación. 21 3.- sistema inmune de las plantas. 22 4.- balance hormonal durante la reacción de defensa. 24 5.- e3 ligasas como componentes especíhcos en la defensa de plantas. 25 6.- phorl. 28 objetivos. 31 1.-objetivos generales. 31 2.- objetivos específicos. 31 materiales y métodos. 33 1.- material vegetal y condiaones de crecimiento de las plantas. 33 2.-generación de plantas transgénicas. 34 3.- expresión y purificación de proteínas recombinantes. 35 3.1.-purificación de phorl-st. 36 3.2.- purificación de las proteínas de fusión a gst. 36 4.-análisis por western blot. 37 5.-análisis por northern blot. 37 6.- ensayo de interacción de las della con phorl. 38 6.1.- traducciones in vitro. 38 6.2.-ensayos de pull-down. 39 7.- amplmcación y clonaje de rga y sus diferentes fragmentos derivados. 39 8.- traducción in vitro y ensayos de interacción pull-down de los fragmentos de rga. 41 9.- ensayos de ubiquitinación in vitro. A2 10.- interacción de phorl con giberelinas. 42 11.- estudios de localización subcelular de phorl-gfp. 43 12.- ensayos de una asociasión de phorl al sistema de endomembranas. 44 13.- gradiente de sacarosa y colocalización con el marcador lipofílicofm4-64. 44 14.- complementación bimolecular fluorescente. 46 15.- producción y purificación del anticuerpo anti-della. 47 16.- análisis por western blot de los niveles endógenos de las proteínas della. 48 17.- infecciones de plantas con patógenos biótrofos y necrótrofos. 48 resultados. 50 1.- conservación de la función de phorl en arabidopsis. 50 1.1.- identincación de los ortólogos de phorl en arabidopsis. 50 1.2.- migración al núcleo dependiente de gas de la fusión phorl-gfp en arabidopsis. 51 2.- asociación de phorl a membranas vesiculares. 52 2.1.- phorl es una proteína periférica de membrana. 52 2.2.- phorl esta asocl\da a endosomas de alta densidad. 54 2.3.- phorl esta asociada a vesículas de tráfico intracelular. 55 3.- expresión y purificación de proteínas recombinantes. 58 3.1.- phorl::Step-tag. 59 3.2.- fusiones de las proteínas 5rarcl,^rslyl, qígidl, ^ígai, ^/pub27, ^/pub28 y ^/pub29 a gst. 59 4.- interacción de phorl y sus ortólogos de arabidopsis con la proteína represora rga. 61 4.1.- interacción de las proteínas phorl y rga en ensayos p£zll-i>0«w. 61 4.2.- identificación de los dominios de la proteína rga reconocidos por phorl. 62 4.3.- phorl interacciona con rga in vivo. 64 5.- actividad e3 ligasa de phorl. 65 6.- ensayo degradación in vitro de las proteínas della. 66 7.- interacción de phorl con gas. 67 111 8.- producción de un anticuerpo policlonal anti-della. 69 8.1.-expresión del antígeno utilizado parala producción del anticuerpo. 69 8.2.-purificación y titulación del anticuerpo. 71 9.- fenotipos causados por la sobre-expresión de phorl. 73 10.- phorl recupera parcialmente el fenotipo enano delmütame sfyl-jo. 74 11.- función de phorl en la ruta de señalización de defensa. 75 11.1.- los genes ortólogos pub de arabidopsis se inducen tras el tratamiento con elicitores. 75 11.2.- las líneas phorl-oe son resistentes a la inhibición del crecimiento de la raíz inducida porflg22. 77 11.3.- las proteínas della medlvn la inhibición del crecimiento de la raíz tras el tratamiento con flg22. 78 11.4.- las líneas phorl-oe son más resistentes a infecciones por el patógeno biótrofo pseudomonas syringae (ps/dc3000) y más susceptibles al hongo necrótrof05o/ryíi5c//ierea. 81
