Aplicación de la citometría de flujo al estudio en tiempo real de las interacciones entre especies reactivas de oxígeno y nitrógeno en el estrés oxidativo inducido por xenobióticos
- Autores: Beatriz Jávega Martínez
- Directores de la Tesis: José Enrique O'Connor Blasco (dir. tes.), Guadalupe Herrera Martin (codir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de València ( España ) en 2022
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Alberto Manuel Alvarez Barrientos (presid.), Alicia Martínez Romero (secret.), Jordi Petriz Gonzalez (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina y Biotecnología por la Universitat de València (Estudi General)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno (NOS) presentan un destacado interés para diversos contextos de la medicina experimental y clínica. Ambas especies desempeñan una doble función en los sistemas biológicos aerobios, ya que favorecen tanto procesos metabólicos como celulares, mientras que, dada su acción oxidante, han sido asociadas con numerosas enfermedades, así como con el proceso de envejecimiento. A pesar de la poderosa y compleja maquinaria antioxidante de los organismos superiores, cuando la capacidad de estos mecanismos protectores es superada por la intensidad o duración de los procesos oxidativos, se produce una situación denominada estrés oxidativo, que se define como una alteración en el equilibrio entre la producción de ROS y las defensas antioxidantes, produciendo daño oxidativo.
El estudio experimental de la actividad y el estrés oxidativo es un aspecto complicado debido a la complejidad de los procesos bioquímicos implicados y por la limitada vida media de las diferentes ROS y RNS que participan en los mismos. La citometría de flujo (CMF) se utiliza con gran frecuencia para el estudio cuantitativo de la generación intracelular de ROS y RNS gracias a la disponibilidad de diversos tipos de sustratos fluorogénicos y fluorocromos. El uso de sondas fluorescentes parece un enfoque simple y fácil para la detección y cuantificación de la producción de ROS y RNS en sistemas celulares. Sin embargo, hay muchas limitaciones y artefactos en esta metodología. Es por ello, que el objetivo principal del presente estudio es evaluar los problemas de especificidad de las sondas fluorescentes y la participación de diferentes ROS en diversas condiciones de estrés oxidativo.
Los estudios citómicos se han desarrollado sobre células eucariotas (líneas celulares Jurkat y N13) y células procariotas (cepas de Escherichia coli B deficientes en la defensa antioxidante) con diferentes sustratos fluorogénicos y combinaciones de estos. Para ello se emplean diversos xenobióticos generadores de ROS y RNS. Se desarrollan ensayos por CMF que permiten detectar e interpretar posibles interferencias entre sustratos fluorogénicos y de los sustratos fluorogénicos con el sistema biológico que pueden limitar la aplicabilidad de ensayos multiparamétricos de estrés. Además, para abordar fenómenos temporales relacionados con la generación de ROS y RNS, se emplea la CMF en tiempo real.
Se presenta un estudio en el que ha sido posible diseñar y desarrollar en diferentes modelos experimentales, ensayos por CMF que permiten medir la generación de ROS y RNS con diferentes sustratos fluorogénicos en suspensiones celulares tratadas con diversos xenobióticos. Ello nos ha permitido evaluar de forma objetiva las ventajas y limitaciones de una serie de sondas fluorescentes de relevancia en estudios experimentales de estrés oxidativo o nitrosativo. Aunque existen discrepancias en los ensayos multiparamétricos se propone una serie de recomendaciones para el diseño de paneles por CMF de estrés oxidativo.
