Nuevas aplicaciones del Sistema Maldi-Tof Ms en la microbiología clínica
- Autores: Ignacio Torres Fink
- Directores de la Tesis: David Navarro Ortega (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de València ( España ) en 2022
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Concepción Gimeno Cardona (presid.), María Angeles Clarí Pons (secret.), Rafael Maria Cantón Moreno (voc.)
- Programa de doctorado: Programa Oficial de Doctorado en Medicina
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- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
La espectrometría de masas es una técnica de determinación estructural que permite estudiar la distribución de las moléculas de una sustancia en función de su masa. Un espectro de masas es una relación de las especies iónicas presentes en una muestra, expresadas en función de su masa/carga (m/z) y la abundancia relativa (intensidad) de cada una en la muestra. La espectrometría de masas fue utilizada históricamente como una técnica analítica de la química clínica, pero no fue hasta hace tres décadas con la aparición de las técnicas de “ionización suave” cuando se consiguió analizar biomoléculas de gran tamaño utilizando un láser como fuente de ionización y una matriz orgánica para facilitar el proceso. De ahí el nombre MALDI-TOF, que obedece a las siglas Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight o ionización-desorción asistida por matriz con tiempo de vuelo. Esta diferencia respecto de otro tipo de espectrómetros es la que va a permitir que se produzcan muchas menos fragmentaciones en la muestra y que la interpretación del espectro generado sea más sencilla. Cuánto más grande es la molécula que se quiere analizar, más complejo es el proceso de análisis cuando esta se fragmenta en múltiples iones. Sin embargo, si la molécula permanece prácticamente intacta, se generará un espectro con un número mínimo de especies iónicas, que será mucho más sencillo de analizar. De ahí su gran éxito en la Microbiología Clínica.
Desde la irrupción de la espectrometría de masas MALDI-TOF en los laboratorios de Microbiología Clínica, se ha producido una revolución en el diagnóstico microbiológico. En el momento actual, la espectrometría de masas MALDI-TOF es una de las técnicas más utilizadas en la rutina de los laboratorios para la identificación de microorganismos, tanto de bacterias, como micobacterias, levaduras y hongos lamentosos. Con respecto a esta aplicación, el rango de masas de interés está entre los 2.000 Da y los 20.000 Da. La mayoría de los picos de masas que se obtienen en este rango representan proteínas ribosómicas. El conjunto de estos picos de masas constituye el espectro del microorganismo y éste se va a considerar una huella peptídica. Este concepto hace alusión a la singularidad del espectro generado para cada especie microbiana. El perfil proteico generado se compara finalmente con los perfiles proteicos almacenados para cada microorganismo en la base de datos del equipo que se esté́ utilizando, de forma que se pueda emitir un informe de identificación en unos pocos segundos.
Las ventajas universales de la espectrometría de masas MALDI-TOF son el alto rendimiento, el bajo coste en reactivos, la aplicación en muestras sólidas y la facilidad de uso. La principal desventaja es el alto coste del equipo, la imposibilidad de identificar microorganismos muy relacionados entre sí́, o microorganismos que no estén presentes en la base de datos. Con el tiempo, estas limitaciones seguramente serán menores, ya que el precio de las tecnologías suele descender con el tiempo.
En el momento actual los microbiólogos requerimos un mayor número de aplicaciones de esta tecnología, como su utilización directa en muestras clínicas, detección de resistencias o tipado, diagnóstico de las infecciones producidas por virus, entre otros.
En relación a la utilización de esta técnica directamente en muestras clínicas, la identificación rápida de bacterias de hemocultivos permite el inicio oportuno de una terapia antibiótica óptima para las infecciones del torrente sanguíneo, y esto impacta dramáticamente en la supervivencia del paciente. De hecho, en casos de bacteriemia, el riesgo de mortalidad se duplica con un retraso de 24 h en la provisión de antibióticos apropiados. En este contexto, realizar una tinción de Gram inmediatamente después de que se detecte como positivo los hemocultivos, y comunicar los resultados rápidamente al médico tuvo un impacto positivo en la selección apropiada de antibióticos, lo que condujo a una disminución de la mortalidad. La espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización asistida por matriz (MALDI-TOF MS) se usa cada vez más para el diagnóstico etiológico de rutina de las infecciones del torrente sanguíneo. Con el fin de mejorar su rendimiento, se han implementado diferentes métodos de preparación de muestras, especialmente el método de extracción de proteínas bacterianas/fúngicas de etanol/ácido fórmico. Sin embargo, el uso de estos métodos da como resultado un tiempo de procesamiento práctico adicional y mayores costos. Se ha desarrollado un enfoque práctico y simple para eludir el paso de extracción de proteínas requerido en la preparación para el análisis MALDI-TOF MS: requiere un cultivo previo a corto plazo de hemocultivos positivos en medio sólido, y la biomasa en crecimiento se usa para MALDI-TOF MS identificación microbiana. Se ha demostrado que este método facilita la identificación bacteriana muy temprana y fiable a partir de hemocultivos positivos. La identificación MALDI-TOF MS de patógenos bacterianos cultivados en hemocultivos después de una breve incubación en medio sólido se asocia con una reducción en la duración del riesgo de hospitalización y mortalidad en pacientes adultos y pediátricos.
Aquí, realizamos un estudio cuasiexperimental pre-post destinado a evaluar el valor potencial de agregar una identificación bacteriana rápida por MALDI-TOF MS a la información proporcionada por la tinción de Gram para adaptar regímenes antibióticos empíricos sin guía de administración antimicrobiana en pacientes con BSI admitidos a salas oncohematológicas y de cuidados intensivos.
Por otro lado, la resistencia bacteriana a los antibióticos ha aumentado en los últimos años. En 2013, los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) publicaron un informe que describe las 18 principales amenazas resistentes a los medicamentos: las Enterobacterias resistentes a los carbapenem, Acinetobacter baumannii y Pseudomonas aeruginosa resistentes a múltiples fármacos, Candida resistente a fluconazol, Enterobacterias productoras de Betalactamasas de Espectro Extendido (BLEE), Enterococos resistentes a vancomicina, y Staphylococcus aureus resistente a meticilina. El tiempo empleado hasta que se proporcionen resultados microbiológicos es inversamente proporcional al valor médico, por ello, se necesitan urgentemente pruebas para el diagnóstico rápido de infecciones producidas por estos microorganismos.
La espectrometría de masas MALDI-TOF MS ha irrumpido como uno de los métodos rápidos principales para detectar la resistencia a los antimicrobianos. Se utilizan tres enfoques principales para detectar la resistencia a los antimicrobianos mediante MALDI-TOF MS: la detección de la resistencia a los antimicrobianos mediante la medición de las modificaciones a los antibióticos debido a la actividad enzimática de las bacterias, el análisis de los patrones máximos de las bacterias y la semicuantificación del crecimiento bacteriano en presencia de un antibiótico. El principal problema de estos enfoques es que son métodos laboriosos y complejos, y por ello, no ha sido posible instaurarlos en la rutina de los laboratorios de Microbiología Clínica. De ahí que se necesite seguir investigando en este campo para desarrollar métodos más sencillos que puedan ser aplicados de forma sencilla y efectiva, que suponga un impacto clínico beneficioso para el paciente.
Con respecto al diagnóstico de las infecciones causadas por virus, la tecnología MALDI-TOF MS no ha evolucionado de la misma manera que las causadas por bacterias. Por el momento, solo se ha conseguido la identificación y/o tipificación molecular de una amplia gama de virus, pero siempre tras un primer paso con cultivos celulares o mediante el acoplamiento de MALDI-TOF MS con procedimientos de amplificación de ácido nucleico en los que las secuencias específicas del genoma viral se amplifican por PCR, y luego los amplicones se analizan mediante procedimientos de espectrometría de masas. Pero ninguno de estos métodos se ha podido realizar directamente a partir de muestras clínicas.
Los enterovirus (EV), que pertenecen a la familia Picornaviridae, causan enfermedades neurológicas, con frecuencia meningitis y encefalitis asépticas, especialmente en edades pediátricas. La detección rápida de la meningitis EV es esencial para tomar decisiones vitales de tratamiento y tratamiento del paciente. De hecho, la provisión oportuna de los resultados de las pruebas de EV tiene un gran impacto en la atención médica y se ha demostrado que es rentable. Actualmente, los ensayos de PCR de transcripción inversa en tiempo real para detectar ARN EV en el líquido cefalorraquídeo (LCR) son el estándar de oro para el diagnóstico de enfermedades neurológicas relacionadas con EV. El perfil proteómico del LCR por espectrometría de masas se ha utilizado con éxito para diagnosticar y calificar una serie de otras enfermedades neurodegenerativas, incluidas la esclerosis lateral amiotrófica y la esclerosis múltiple.
Sugerimos, por tanto, que nuevos desarrollos en los métodos basados en la tecnología MALDI-TOF MS podrían incrementar el rendimiento y reducir los costes de procedimientos en uso para la identificación de bacterias y hongos causantes de bacteriemia/fungemia a partir de hemocultivos positivos y la detección rápida de resistencia bacteriana a los antibióticos. Además, la tecnología MALDI-TOF MS puede ser utilizada para el diagnóstico etiológico de meningitis/encefalitis víricas utilizando el líquido cefalorraquídeo como matriz de análisis.
Esta tesis doctoral incluye 4 objetivos específicos principales: I. Desarrollo de un nuevo método para la identificación rápida de bacterias directamente de hemocultivos positivos (Artículo I).
Para conseguir la identificación bacteriana con MALDI-TOF MS a partir de un frasco de hemocultivo positivo, los procesos consisten básicamente en concentrar las bacterias presentes en la muestra y retirar los componentes que puedan interferir en el proceso de identificación, tales como células humanas u otras sustancias del medio de cultivo. Existen diferentes protocolos que han conseguido acelerar la identificación de bacterias a partir de hemocultivos, entre los que destacan el método comercial MALDI Sepsityper kit (Bruker Daltonics, MA, USA) y la incubación corta en medio sólido. El primer caso se basa en un protocolo de extracción de proteínas con etanol y ácido fórmico, incluyendo durante el proceso una serie de pasos de centrifugación diferencial y lavado para aislar las bacterias en el sobrenadante y eliminar sustancias que puedan interferir en el análisis por MALDI-TOF MS. El segundo caso está basado en una incubación corta de un pequeño volumen de sangre en agar sangre Columbia. La biomasa obtenida se somete al análisis por MALDI-TOF MS. No obstante, ambas estrategias presentan ciertos inconvenientes. El primer enfoque se asoció con un procesamiento de muestra más complejo y con peores resultados en la identificación exitosa de cocos Gram-positivos. Por el contrario, la identificación a partir de incubación en medio sólido resultó ser un proceso más sencillo e integrable en la rutina del laboratorio, además de obtenerse mejores resultados para bacterias Gram-positivas, aunque el tiempo necesario para alcanzar la identificación exitosa se demora por encima de las 4 horas.
El rápido aumento de la biomasa bacteriana producida al incubar los hemocultivos en un medio líquido altamente nutritivo podría permitir una identificación de especies bacterianas más rápida y precisa. En este contexto, desarrollamos un nuevo método de identificación basado en el enriquecimiento a corto plazo en medio líquido que fue comparado con otros ya existentes, incluyendo al MALDI Sepsityper kit y la generación de biomasa en medio sólido tras una incubación corta.
II. Realizar un estudio cuasiexperimental pre-post destinado a evaluar el valor potencial de agregar una identificación bacteriana rápida por MALDI-TOF MS a la información proporcionada por la tinción de Gram para adaptar regímenes antibióticos empíricos sin guía de administración antimicrobiana en pacientes con bacteriemia ingresados en salas oncohematológicas y de cuidados intensivos (Artículo II).
Los laboratorios de microbiología clínica tienen un papel clave en el manejo de la bacteriemia porque son los primeros en estar en condiciones de registrar la infección a partir de los hemocultivos positivos. Estudios previos han demostrado que la realización de la tinción de Gram inmediatamente después de que los hemocultivos sean marcados como positivos y la comunicación rápida de los resultados al médico tienen un impacto positivo en la selección adecuada de antibióticos, lo que conduce a una disminución de la mortalidad. Este impacto es incluso mayor en el uso de antimicrobianos que los resultados proporcionados por los estudios de sensibilidad antibiótica. Sin embargo, la evaluación de los resultados de la tinción de Gram y el examen microscópico es bastante subjetiva y está influenciada por la habilidad y la experiencia del microbiólogo. Por lo tanto, los resultados de la tinción de Gram en ocasiones son inconsistentes con la identificación final de los microorganismos, lo que representa un riesgo que puede conducir a una terapia antimicrobiana inadecuada y por ello, afectar de forma negativa en el curso clínico.
Está claro que la práctica antimicrobiana actual tiende hacia el uso de agentes de amplio espectro para la cobertura empírica de infecciones graves. En parte, esto se debe al aumento de las tasas de resistencia a los antimicrobianos, combinado con la reticencia de los médicos a reducir la cobertura antibiótica en el contexto de una mejoría clínica.
La identificación microbiana rápida directamente de hemocultivos mediante MALDI-TOF MS proporciona más información acerca del agente causal de la bacteriemia y, por tanto, permite potencialmente a los médicos adaptar la terapia antibiótica antes de que los resultados de las pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos están disponibles. En este marco, evaluamos el potencial añadido de utilizar el nuevo método de identificación bacteriana rápida por MALDI-TOF MS desarrollado por el grupo a la información proporcionada por la tinción de Gram para adaptar la terapia antibiótica en pacientes de alto riesgo con bacteriemia.
III. Desarrollo de un nuevo método fenotípico de cribado rápido de resistencias antibióticas a partir de hemocultivos positivos mediante la tecnología MALDI-TOF MS (Artículo III).
La expansión de patógenos bacterianos resistentes a los antibióticos es una amenaza seria y global. En la actualidad, la terapia empírica con antibióticos de amplio espectro es a menudo inadecuada debido a la frecuente implicación de bacterias multirresistentes, entre las cuales, las Enterobacterias resistentes a cefalosporinas de tercera generación (Ceph3) son de especial preocupación por el aumento de prevalencia y su asociación con una mayor mortalidad.
La tecnología MALDI-TOF MS destaca por ser un procedimiento rápido y sencillo que combina las ventajas de los ensayos fenotípicos con la rapidez y precisión de los ensayos moleculares. Se han desarrollado varios enfoques para la detección de la resistencia a los antimicrobianos mediante esta tecnología, basados en las modificaciones de los antibióticos debidas a la actividad enzimática de las bacterias, el análisis de los patrones máximos de las bacterias y la semicuantificación del crecimiento bacteriano en presencia de un dado antibiótico.
En este contexto, otras técnicas como los inmunoensayos de flujo lateral (LFIA) también se han utilizado cada vez más para detectar β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) en Gram-negativos de colonias aisladas o directamente de hemocultivos, ya que son fáciles de usar y arrojan resultados rápidos y confiables.
La detección de la resistencia de Enterobacterias a las Ceph3 mediante MALDI-TOF MS se puede lograr comparando el crecimiento bacteriano en presencia o ausencia de un antibiótico dado, seguido de una medición semicuantitativa de las proteínas bacterianas. En este sentido, pretendimos optimar el nuevo método de identificación bacteriana rápida de hemocultivos positivos desarrollado para la detección rápida de resistencia a Ceph3 en cepas de Escherichia coli y Klebsiella spp.
IV. Evaluación de un método MALDI-TOF MS con líquido cefalorraquídeo para el diagnóstico de meningitis/encefalitis víricas (Artículo IV).
El uso de MALDI-TOF MS en el diagnóstico de infecciones víricas a partir de muestras clínicas no ha evolucionado al mismo ritmo que la identificación bacteriana y fúngica, debido principalmente a su relativa baja sensibilidad. Hasta la fecha, la identificación del virus en muestras clínicas utilizando este enfoque metodológico se ha logrado solo después del cultivo celular o en combinación con técnicas de PCR. Por otra parte, la búsqueda de perfiles proteómicos específicos en el líquido cefalorraquídeo (LCR) puede proporcionar información importante sobre diferentes procesos patogénicos. Estudios previos han utilizado con éxito el perfil proteómico del LCR obtenido mediante espectrometría para diagnosticar y clasificar otras enfermedades neurodegenerativas, como la esclerosis lateral amiotrófica y la esclerosis múltiple.
En este estudio de prueba de concepto pretendimos determinar si existe un perfil proteómico del LCR que esté específicamente asociado con la meningitis/encefalitis por Enterovirus, de modo que permita el diagnóstico rápido y a muy bajo coste de dichas infecciones.
Resultados: En el primer trabajo, tras el desarrollo de un método basado en la incubación corta de hemocultivos positivos en medio líquido, observamos que, en general, este precultivo en BHI previo al procesamiento por MALDI-TOF MS supera en términos de identificación exitosa y rapidez tanto al MALDI Sepsityper kit como al precultivo en medio sólido, métodos actualmente disponibles.
Son varios los trabajos en los que, como nosotros, se observa un menor rendimiento del MALDI Sepsityper kit especialmente para cocos Gram-positivos, con respecto a otros métodos de identificación rápida. El enriquecimiento con BHI logró la identificación correcta a nivel especie del 91,6% de los hemocultivos positivos frente al 65,4% para el método basado en la extracción de proteínas. Nuestro método obtuvo mejor rendimiento que este tanto para bacilos Gram-negativos como para cocos Gram-positivos.
Mediante el método de precultivo en medio sólido se logró identificar correctamente el 89,2% de los aislamientos, un resultado ligeramente menor al obtenido tras la incubación en medio líquido. Este rendimiento es superior al informado por otros estudios, en los que no se superaba el 85%. Sin embargo, el uso de diferentes instrumentos, procesamientos de muestra, análisis MALDI-TOF MS y reglas de interpretación hace difícil la comparación entre todos estos trabajos. Al igual que en nuestro estudio, como era esperable, los resultados de identificación fueron mejores para las bacterias Gram-negativas que para las Gram-positivas.
Se cree que el rápido aumento de la biomasa bacteriana producida por la incubación en un medio líquido altamente nutritivo está relacionado con una reducción en el tiempo requerido para alcanzar una identificación exitosa a nivel de especie. Nosotros observamos que el precultivo en BHI redujo notablemente el tiempo para lograr una identificación exitosa a nivel de especie tanto para bacilos Gram-negativos, especialmente en Enterobacterias, como para cocos Gram-positivos con respecto al precultivo en agar sangre. La combinación con un método de extracción de proteínas podría aumentar aún más el rendimiento de nuestro método. Sin embargo, esto aumentaría la complejidad del método y su tiempo de manipulación.
En el segundo trabajo, evaluamos el valor potencial de la identificación bacteriana rápida por MALDI-TOF MS sumado a la información proporcionada por la tinción de Gram en pacientes con bacteriemia ingresados en salas de oncohematología y cuidados intensivos, donde la elección adecuada de los regímenes antibióticos empíricos prescritos y la pronta adaptación de la terapia en caso de una selección errónea de antimicrobianos tiene un gran impacto en la supervivencia del paciente.
Nosotros observamos que, en ambas fases del estudio, la información proporcionada por la tinción de Gram resultó ser valiosa a la hora de adaptar terapias antibióticas empíricas, lo que condujo a una reducción sustancial de los pacientes regímenes terapéuticos empíricos incorrectos, en línea con los informes anteriores. Esto también indujo un aumento del número de pacientes que recibieron esquemas mejorables durante la fase pre- y post-MALDI-TOF MS y tratamientos correctos durante la fase posterior al uso de esta tecnología. Cabe destacar que el número de intervenciones en base a los resultados de la tinción de Gram se redujo a la mitad durante la fase con identificación bacteriana rápida, probablemente debido a que el médico prescriptor era conocedor de que esta información estaría disponible poco después de recibir los resultados de la tinción de Gram.
La introducción de la tecnología MALDI-TOF MS en el diagnóstico de rutina de bacteriemias llevó a un aumento sustancial (15,7%) del número de pacientes que cambiaron a esquemas de tratamiento correcto. Este dato es similar a otros estudios donde encontraron que el uso de MALDI-TOF MS aumentó la proporción de terapia antimicrobiana apropiada en un 11,3% (64% versus 75,3%; P<0,001).
En nuestro trabajo, el porcentaje de pacientes que permanecieron bajo regímenes de antibióticos incorrectos después de los ajustes no fue significativamente diferente al de la fase de estudio previa a MALDI-TOF MS. Es de interés subrayar que se observaron diferencias en cuanto al impacto de los resultados de la EM MALDI-TOF según la sala de hospitalización (oncohematología vs. unidad de cuidados intensivos), quizás debido a la ausencia de criterios homogéneos para los ajustes tempranos de antibióticos en todos los pacientes. estas unidades. En este sentido, aunque especulativo, planteamos la hipótesis de que la intervención de un equipo de administración antimicrobiana en el manejo terapéutico de nuestros pacientes habría resultado en una selección más adecuada de los regímenes antibióticos empíricos en base a la información proporcionada no solo por la tecnología MALDI-TOF MS, sino también los resultados de la tinción de Gram, como se demostró anterior e independientemente de la sala de hospitalización.
En el tercer trabajo, optimizamos y evaluamos prospectivamente nuestro método de identificación bacteriana rápida de hemocultivos positivos basado en MALDI-TOF MS para detectar resistencia a Ceph3 en Enterobacterias, omitiendo la evaluación semicuantitativa de proteínas bacterianas. En este contexto, también los comparamos con el inmunoensayo NG-Test CTX-M MULTI que permite la detección de los productores de BLEE tipo CTX-M. Nos enfocamos en pacientes que desarrollaron infecciones del torrente sanguíneo causadas por E. coli y Klebsiella spp. por su afectación especialmente frecuente en nuestro medio (>90%).
Nuestro método, que utilizó una concentración de CRO muy por encima del punto de corte de susceptibilidad para Enterobacterias, clasificó correctamente el 91,8% de las cepas resistentes con cuatro errores muy importantes (falsa sensibilidad) y el 98,3% de las cepas sensibles con dos errores importantes (falsa resistencia). La sensibilidad general del "mundo real" del método MALDI-TOF MS fue del 91,8% (IC 95%, 80,8-96,8%) y su especificidad fue del 98,3% (IC 95%, 94,1-99,5%). Las cepas discordantes se volvieron a analizar mediante la inoculación en frascos de hemocultivos, obteniendo categorización correcta en todas menos una. Esto sugiere que puede haber ocurrido un error operativo durante el procedimiento como el uso de inóculos demasiado bajos o altos. Quizá la estandarización de la preparación del inóculo podría evitar estos errores, pero a costa de aumentar el tiempo de manipulación y, por lo tanto, minimizar la simplicidad del protocolo. No obstante, según nuestra experiencia, basta con una formación adecuada del personal para conseguir una precisión adecuada.
El método MALDI-TOF MS que evaluamos aquí, como se indicó, no implica el uso de programas de software auxiliares y omite la extracción de proteínas, lo que hace que el proceso operativo sea más simple y rápido.
El ensayo NG-Test CTX-M MULTI es una técnica inmunocromatográfica que permite la detección de BLEE tipo CTX-M, mecanismo principal de resistencia a Ceph3 en E. coli y Klebsiella spp. en nuestro medio. Nuestro trabajo obtuvo una concordancia del 100% entre el LFIC y el método basado en MALDI-TOF MS. Las tres cepas resistentes que mostraban otros marcadores genotípicos que mediaban la resistencia a las Ceph3 dieron negativo en el ensayo IC, al igual que todas las cepas susceptibles.
En el último trabajo se buscó identificar pequeñas proteínas presentes en muestras de LCR que se expresan diferencialmente entre pacientes con o sin meningitis por Enterovirus mediante el uso de perfiles proteómicos obtenidos por MALDI-TOF MS.
Inicialmente realizamos un análisis experimental que nos permitió construir un modelo que incorpora 30 picos que pueden permitir la discriminación entre muestras de LCR con resultados positivos o negativos para ARN de EV mediante RT-PCR. La presencia o ausencia en la muestra de los diferentes picos del modelo proporciona información relevante pero no definitiva en cuanto a su categorización final como EV positivo o EV negativo; de hecho, la contribución relativa de cada pico al modelo se pondera teniendo en cuenta el resto de los picos sobre los que se construye el modelo. La precisión general del modelo fue de alrededor del 93% y, en particular, clasificó correctamente el 93% tanto de muestras EV positivas como negativas.
Adicionalmente, para confirmar la capacidad de discriminación del modelo se utilizó un grupo de muestras de validación para las cuales la precisión fue ligeramente inferior (84%), probablemente debido al menor tamaño muestral. Este método pudo categorizar correctamente todas las muestras negativas para EV excepto una que resultó positiva para el VHS-1.
Una de las principales ventajas de este método es que se puede completar en menos de 40 minutos a un coste muy bajo (aproximadamente 3€ por muestra), que es sustancialmente menor que el de las técnicas de RT-PCR disponibles comercialmente. El protocolo de precipitación de proteínas se lleva a cabo en menos de 10 minutos y emplea productos disponibles en todos los laboratorios, y el análisis MALDI-TOF-MS se realiza bajo las condiciones utilizadas para la identificación rutinaria de bacterias y levaduras.
Teóricamente, los picos que contribuyen a la elaboración de nuestro modelo pueden corresponder a componentes integrales de partículas virales, proteínas celulares o ambos. En un trabajo reciente pudieron discriminar correctamente entre diferentes EV utilizando los perfiles proteómicos obtenidos por MALDI-TOF MS previo paso por cultivo celular. Todos los espectros que obtuvieron tenían dos comunes a aproximadamente 3700 y 7500 m/z correspondientes a las proteínas estructurales de EV más abundantes, VPg y VP4. En nuestro trabajo no encontramos ninguno de estos picos en las muestras positivas para EV. Esto se podría atribuir a que las proteínas virales en otras matrices, como LCR, pueden haberse fragmentado debido a la actividad de las proteasas locales, en contraste con lo que cabría esperar de los ensayos que utilizan virus purificados.
Conclusiones: I. El método desarrollado para la identificación directa de bacterias a partir de hemocultivos positivos, basado en la incubación corta de un pequeño volumen de estos en caldo de enriquecimiento BHI y posterior análisis mediante MALDI-TOF MS es preciso, reproducible y de bajo coste.
II. La implementación del método desarrollado para la identificación directa de bacterias a partir de hemocultivos positivos ofrece una información valiosa añadida a la derivada del análisis microscópico tras la tinción de Gram para el ajuste de los tratamientos antimicrobianos empíricos en pacientes ingresados en la UCI o unidades de pacientes oncohematológicos.
III. El método MALDI-TOF MS desarrollado permite la categorización de Escherichia coli y Klebsiella spp. causantes de bacteriemia en sensibles o resistentes a cefalosporinas de 3ª generación mediada con rapidez y fiablemente.
IV. El perfil proteómico de muestras de líquido cefalorraquídeo obtenido mediante MALDI-TOF MS puede permitir el diagnóstico de las meningitis/encefalitis causadas por Enterovirus.
