Factor affecting the quality and competence of the sheep oocyte. Use of melatonin to preserve the quality
- Autores: Alicia Isabel Martín Maestro Conesa
- Directores de la Tesis: Ana Josefa Soler Valls (dir. tes.), Irene Sánchez Sánchez Ajofrín (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Castilla-La Mancha ( España ) en 2022
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: María Teresa Paramio Nieto (presid.), Beatriz Macías García (secret.), Andreina Cesari (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Ciencias Agrarias y Ambientales por la Universidad de Castilla-La Mancha
- Materias:
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- Resumen
Las técnicas de reproducción asistida (TRA) son una herramienta clave en la conservación de especies, así como en el aumento de la productividad y rentabilidad de los animales de granja mediante un mayor control de la función reproductiva. Sin embargo, en el caso de los pequeños rumiantes, tales como cérvidos y ovinos, las técnicas más desarrolladas han sido únicamente la inseminación artificial y la transferencia de embriones, dejando a un lado otras técnicas como la producción in vitro de embriones (PIV) debido al bajo rendimiento de la misma. El escaso desarrollo de la PIV muestra la necesidad de controlar o al menos conocer los factores limitantes de esta técnica.
El primer paso durante PIV es la recolección de ovocitos de alta calidad y competencia para el desarrollo embrionario. Para especies silvestres, como el ciervo ibérico, la recogida de muestras representa un problema ya que el sacrificio de los animales suele realizarse lejos de los laboratorios, implicando tiempos de transporte prolongados hasta la recolección y procesado de los ovocitos. Esto puede influir negativamente en la capacidad de desarrollo de los ovocitos inmaduros y, por lo tanto, en su calidad. Del mismo modo, la recolección de muestras durante la temporada de verano, cuando las temperaturas son altas, da como resultado un aumento de la temperatura corporal que puede disminuir la calidad de los ovocitos y la competencia del embrión. Dichos factores pueden afectar la eficiencia de la técnica de producción de embriones in vitro por lo que conservar la calidad de los ovocitos podría mejorar el número de embriones obtenidos y aumentar la rentabilidad de la técnica para rumiantes.
Los trabajos llevados a cabo en la presente Tesis Doctoral tienen como objetivo comprender los factores por los que la calidad de los ovocitos obtenidos se ve afectada, así como mejorar la preservación de la calidad de los mismos hasta que se procesan los ovarios con el fin último de aumentar el rendimiento de la PIV en pequeños rumiantes. En algunos experimentos, la especie ovina fue utilizada como modelo de pequeño rumiante por la disponibilidad de muestras.
En el primer capítulo de la Tesis se estudiaron los eventos celulares y moleculares relacionados con la competencia de los ovocitos a lo largo del tiempo tras del sacrificio del animal, con el fin de comprender cómo puede verse afectada la calidad de los ovocitos, y por ende, la competencia del embrión. Se estudió el efecto del tiempo de almacenamiento de los ovarios (3, 5, 7, 9, 11 y 13 h) y el medio en el que fueron transportados (TCM199 y solución salina) sobre la calidad de los ovocitos y su competencia de desarrollo. Para ello, distintos parámetros fueron evaluados: viabilidad, fragmentación del ADN, estado oxidativo mediante la evaluación del contenido de glutatión (GSH) y especies reactivas de oxígeno (ROS), actividad caspasa-3, potencial y distribución de la membrana mitocondrial, y abundancia relativa de trascritos de ARNm. Tras la maduración in vitro (MIV), también se evaluaron la viabilidad y calidad de las células del cumulus la competencia meiótica y el porcentaje de fertilización, de embriones y la calidad de los blastocistos. Los resultados mostraron que a partir de las 7 horas de almacenamiento, la calidad y la competencia del ovocito se ve afectada.
El segundo capítulo de la presente Tesis se estudió la calidad del ovocito a lo largo de diferentes estaciones del año vinculando la calidad de los mismos a un efecto de la temperatura. Así, los ovocitos recolectados en invierno mostraron una mayor competencia de desarrollo que los ovocitos recogidos en verano y otoño, pudiendo deberse al efecto de las altas temperaturas. Para conocer el efecto de las temperaturas sobre la calidad del ovocito, se llevó a cabo un estudio de estrés por calor. Para ello, se incubaron los ovarios en solución salina a distintas temperaturas: 30ºC, 38,5ºC, 40ºC o 41ºC. Tras el estrés por calor, las temperaturas más altas 40ºC y 41ºC afectaron a la calidad y competencia del ovocito.
El tercer capítulo de la Tesis se centró en la suplementación de melatonina a los medios de transporte de los ovarios, con el fin de prevenir o incluso revertir el daño producido por tiempos prolongados de transporte y así mejorar la competencia del ovocito. Para ello, se evaluó el efecto de diferentes concentraciones de melatonina (10-11, 10-9, 10-7, 10-5 y 10-3 M) sobre la competencia del ovocito y el desarrollo y la calidad de los blastocistos. Los resultados revelaron una respuesta dependiente de la dosis de melatonina utilizada, donde 10-9 M fue el tratamiento más efectivo en términos de calidad de ovocitos y rendimiento de blastocistos bajo condiciones de estrés.
En conclusión, la presente Tesis aporta nueva información sobre los mecanismos por los que se ve afectada la calidad de los ovocitos, especialmente cuando son inevitables tiempos de transporte de ovarios prolongados o temperaturas extremas. Además, también permite comprender cómo la suplementación con melatonina en los medios de transporte de los ovarios preserva la calidad de los ovocitos hasta que se procesan los ovarios, lo que podría promover el uso de tecnologías reproductivas en pequeños rumiantes.
