Resumen de Desarrollo de estomas en Arabidopsis: efectos de alelos sintéticos del regulador maestro mute
Los estomas son válvulas compuestas por dos células localizadas en la epidermis de los órganos aéreos de la planta que realizan el intercambio gaseoso con la atmosfera. Su desarrollo en la planta modelo Arabidopsis thaliana se encuentra dirigido por tres factores de transcripción (FTs) de tipo bHLH que actúan de forma consecutiva y parcialmente solapante: SPCH, MUTE y FAMA, que coordinan el tránsito entre diferentes tipos celulares que constituyen el linaje estomático.
De entre los tres reguladores, MUTE controla el tránsito de meristemoide (M) a célula madre de guarda (¿Guard Mother Cell¿, en inglés; GMC). Las mutaciones de pérdida de función en cualquiera de los tres FTs conducen a la ausencia total de estomas. En nuestro laboratorio, previamente se han descrito dos mutantes para SPCH de pérdida parcial de función o hipomorfos, cuyas mutaciones se encuentran localizadas en el dominio bHLH, spch¿5 y SPCHPPP (de Marcos et al., 2017, Plant Physiol. 174(2), 823¿42). Se ha publicado otro alelo hipomorfo, spch¿2 (MacAlister et al., 2007, Nature 445(7127), 537¿40), cuya mutación está presente en un dominio conservado para los tres reguladores maestros en la región C¿terminal, el dominio SMF (llamado así por las iniciales de las tres proteínas). SPCH y MUTE son parálogos entre sí con una gran homología de secuencia. Además, los estudios filogenéticos sugieren que los genes que los codifican pueden haberse originado por un evento de duplicación en un gen ancestral. Todo ello apunta a que la relevancia funcional de algunos de los residuos aminoacídicos de las proteínas codificadas por SPCH y MUTE podría estar conservada. Bajo este contexto, decidimos trasladar las mutaciones mencionadas de SPCH a la correspondiente secuencia codificante de MUTE y generar tres alelos sintéticos que portasen cada una de las mutaciones, para obtener posteriormente líneas de complementación del mutante de pérdida de función mute¿3, carente de estomas y que presenta letalidad juvenil (Triviño et al., 2013, Plan J 75(5), 808¿22).
En esta tesis doctoral, describimos estos tres alelos inéditos de MUTE: MUTEv5, MUTEPPP y MUTEv2, que complementan la letalidad juvenil de mute¿3 y son capaces de formar estomas en los cotiledones, pero no complementan totalmente las funciones de MUTE. MUTEv5 manifiesta defectos en la capacidad de transición a GMC que conducen a la formación de linajes detenidos, y suponen una alteración del índice estomático (IE), así como errores en el espaciamiento, que implican la formación de estomas en contacto. En MUTEPPP, todos los linajes de la cara abaxial del cotiledón forman estomas, mientras que algunos de la cara adaxial quedan detenidos.
Además, presenta agrupamientos estomáticos en ambas epidermis. En MUTEv2, se observan cotiledones de un tamaño más reducido con un menor número de células de pavimento (¿Pavement Cells¿; PCs), pero su fenotipo epidérmico no indica errores en la capacidad de transición o en el establecimiento del patrón estomático. Asimismo, se ha observado que la severidad del fenotipo estomático en los cotiledones de MUTEv5 es dependiente de la línea analizada, pudiéndose observar líneas con presencia únicamente de linajes detenidos o estomas en contacto, y otras con una combinación de ambos fenotipos. Esta diversidad podría ser explicada asumiendo que el fenotipo es independiente para cada linaje, y se encuentra relacionado con la cantidad de proteína que se acumula en cada uno de ellos, como previamente se ha descrito para spch¿5 (de Marcos et al., 2017, Plant Physiol. 174(2), 823¿42). En este sentido, la dosis de MUTEv5 alcanzada determinaría si se producen o no la detención de los linajes o la formación de estomas en contacto. Por el contrario, para MUTEPPP y MUTEv2 no se observan diferencias entre líneas. Además, con el objetivo de estudiar los mecanismos moleculares que conducen a los defectos epidérmicos observados en MUTEv5 y MUTEPPP, hemos realizado un análisis transcriptómico. Para ello, se han seleccionado dos líneas de MUTEv5 que presentan sólo uno de los dos fenotipos observados (presencia de linajes detenidos y de estomas en contacto), y una línea representativa de MUTEPPP. Con esta aproximación, se ha podido documentar que la capacidad de formar estomas en ambos genotipos radica en que son capaces de inducir correctamente la transcripción de la mayor parte de los reguladores estomáticos y de los genes que son dianas directas de MUTE. Asimismo, analizamos en estas líneas los perfiles transcripcionales de los genes previamente descritos como marcadores de los tránsitos celulares durante el desarrollo de los linajes estomáticos. Estos perfiles indican que los genes asociados al compromiso de adquisición de destino estomático (Ms con destino de GMC) y de GMC temprana se encuentran inducidos en las líneas MUTEv5 y MUTEPPP frente al control, lo que indica un retraso en el tránsito de los linajes y/o la iniciación de más linajes en algunas de las líneas. Igualmente, algunos genes marcadores de identidad de GMC tardía y de la diferenciación de las células de guarda (¿Guard Cells¿; GCs) se encuentran reprimidos. Por tanto, nuestros resultados sugieren que, aunque en los linajes detenidos el precursor estomático presenta morfología de M, su transcriptoma es el de una GMC que no llega a transitar de manera completa, siendo incapaz de dividirse. En los linajes en que la transición se produce, es posible que ocurra más lentamente y unida a una diferenciación estomática deficiente, como refleja la incapacidad para inducir algunos marcadores de tránsito a GC madura. Sin embargo, la morfología de los estomas y el rescate de la letalidad juvenil demuestran que se producen estomas aparentemente normales y que deben ser funcionales. Entre los genes diferencialmente expresados, hemos encontrado que FAMA no se induce correctamente en las líneas de MUTEv5, y, particularmente, en la línea que presenta linajes detenidos, lo que podría estar relacionado con los defectos de transición observados en MUTEv5. La formación de estomas en contacto podría estar asociada al posible retraso en la transición a GMC, aunque se han identificado genes diferencialmente reprimidos, como SDD1 en MUTEv5, FLP en MUTEPPP o MYB16 en ambas variantes, que podrían estar vinculados con la aparición de agrupamientos estomáticos. FLP también participa en la diferenciación de las GCs, por lo que la reducción de su expresión en MUTEPPP podría estar vinculada con la diferenciación deficiente previamente citada. Estos resultados certifican la generación de los dos primeros alelos hipomorfos de MUTE descritos y suponen dos nuevas herramientas para explorar las funciones de este regulador maestro.
