Use of si as a new therapy for glioblastoma (uso de siRNA como una nueva terapia en glioblastoma)
- Autores: Pablo Játiva Carbajal
- Directores de la Tesis: Valentín Ceña Callejo (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Castilla-La Mancha ( España ) en 2021
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Esteban Jesús Morcillo Sánchez (presid.), Inmaculada Posadas (secret.), Chai-Lin Kao (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Ciencias de la Salud por la Universidad de Castilla-La Mancha
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: RUIdeRA
- Resumen
En inglés:
Glioblastomas (GBMs), Grade IV gliomas, are the most common primary brain tumours in adults. The standard-of-care for these tumours typically includes surgical resection –if possible–, temozolomide (TMZ)-based chemotherapy and radiotherapy. Despite these, median survival is approximately 14 months since the primary diagnosis, and 2-year survival is 27.2 %. In case of recurrence, median survival in only 6.2 months. Thus, new therapeutic alternatives are indeed needed to further improve GBM patients survival.
In this work, we propose small interfering RNA (siRNA)-based therapy as an alternative for GBM. siRNAs are 21-nucleotide, double-stranded RNAs which induce specific cleavage of complementary messenger RNAs with the subsequent reduction in the corresponding protein levels. As an oligonucleotide, siRNA is a relatively labile molecule and thus requires to be vectorised to reach the cytoplasm.
Nanoparticles are solid, colloidal nanomaterials of a variety of structures and applications. Some can in fact be used as siRNA vectors if they interact with it to form complexes, protect it from degradation and release it upon transfection. Cyclodextrins (CDs), structurally maltooligosaccharides, are water-soluble nanostructures comprising a lipophilic interior and a hydrophilic surface. Some CDs have actually reached clinical trials and even clinical use, while other CD-derivatives have been regarded as potential DNA and RNA vectors as well. In this work, AMC6, an amphiphilic beta-CD-derivative decorated with 7 oligoethylenimine branches plus 14 hexanoyl chains, has been tested as a siRNA transfection vector. AMC6 proved to complex siRNA in a reversible fashion and to protect it from RNase-mediated degradation.
Specific siRNAs were designed to be vectorized by AMC6, in order to lower the levels of notorious proteins in GBM, in particular p42-MAPK, p44-MAPK, Rheb, and MGMT. Our hypothesis was that a multi-protein knock-down would elicit deleterious effects on GBM cells and/or potentiate the effect of TMZ. AMC6-mediated siRNA transfection indeed proved to be efficient by extensively knocking-down p42-MAPK, p44-MAPK and Rheb in GL261 and T98G glioma cells, and also MGMT in T98G cells. Only very low toxic effects appeared when any of these siRNAs or SCR siRNA were used at a concentration of 100 nM.
Regarding the effects elicited by our standard drug, the GBM cell lines used herein responded very poorly to TMZ. Only at very high concentrations some significant toxicity was detected. When AMC6:siRNA nanoplexes were used in addition to TMZ, we observed a clear potentiation in toxicity in some cases. In particular, in GL261 cells, TMZ toxicity was potentiated by knocking-down p42-MAPK alone or combined with p44-MAPK or Rheb. As for T98G cells, good results were in general obtained with combinations of p42-MAPK plus p44-MAPK and/or Rheb and/or MGMT siRNAs. The best results were obtained by simultaneously knocking down p42-MAPK, p44-MAPK, and Rheb, or p42-MAPK, Rheb, and MGMT, increasing TMZ-induced cell death from 1.5 to 3.3-fold. Altogether, these results suggest that the toxicity exerted by TMZ can be potentiated in GBM cell lines by knocking-down different proteins, thus disturbing different cell pathways involved in GBM cell proliferation and survival. Additionally, a particularly relevant role in the limited response to TMZ seems to rely on the MAPK pathway, given the results involving p42-MAPK and p44-MAPK knock-down.
Preliminary in vivo experiments were conducted in mice to characterise biodistribution of AMC6 and AMC6:siRNA nanoplexes. These experiments showed no toxicity, ubiquitous distribution of both AMC6 and siRNA, and an evident accumulation in the liver, which faded away with time. Their presence was confirmed in their kidneys, spleen, heart, and brain as well. When a transferrin (Tf)-decorated version of AMC6 was used instead, a slightly different biodistribution profile was observed, with an increase in its presence in the brain (about +240 %).
Taken together, the results of this thesis suggest an enormous potential for AMC6 as a siRNA transfection vector. Specific AMC6:siRNA nanoplexes may be a valuable therapeutic alternative for GBM in the future. Hence, further research must be conducted to gain insight into their toxicity and biodistribution profile, as well as their effects on tumours in vivo.
En castellano:
Los glioblastomas (GBMs), gliomas de Grado IV, son los tumores cerebrales primarios más comunes en adultos. El tratamiento estándar para estos incluye típicamente resección quirúrgica –si es posible–, quimioterapia basada en temozolamida (TMZ) y radioterapia. A pesar de ello, la mediana de supervivencia es de aproximadamente 14 meses desde el diagnóstico primario, y la supervivencia a 2 años es del 27.2 %. En caso de recurrencia, la mediana de supervivencia es de solo 6.2 meses. Por tanto, se requieren sin duda nuevas alternativas terapéuticas para mejorar la supervivencia de los pacientes de GBM.
En este trabajo, proponemos la terapia basada en RNA pequeño de interferencia (siRNA) como una alternativa para el GBM. Los siRNAs son RNAs de doble cadena de 21 nucleótidos que inducen la degradación específica de los RNA mensajeros complementarios con la subsiguiente reducción en los niveles de las proteínas correspondientes. El siRNA es una molécula relativamente lábil y por tanto requiere ser vectorizada para alcanzar el citoplasma.
Las nanopartículas son nanomateriales sólidos coloidales con variedad de estructuras y aplicaciones. Algunas pueden ser, de hecho, utilizadas como vectores de siRNA si interaccionan con este para formar complejos, lo protegen de la degradación y lo liberan tras la transfección. Las ciclodextrinas (CDs), estructuralmente maltooligosacáridos, son nanoestructuras solubles en agua que incluyen un interior lipófilo y una superficie hidrófila. Algunas CDs han alcanzado de hecho ensayos clínicos e incluso la práctica clínica, mientras que otros derivados de CDs han sido asimismo considerados como potenciales vectores para DNA y RNA. En este trabajo, AMC6, un derivado anfifílico de beta-CD decorado con 7 ramas de oligoetilenimina más 14 cadenas de hexanoilo, se ha estudiado como un vector de transfección para siRNA. AMC6 demostró complejar el siRNA de manera reversible y protegerlo de la degradación mediada por RNasas.
Se diseñaron siRNAs específicos para ser vectorizados por AMC6, de manera que se redujesen los niveles de proteínas notables en el GBM, en particular p42-MAPK, p44-MAPK, Rheb y MGMT. Nuestra hipótesis consistió en que un silenciamiento multi-proteína provocaría efectos deletéreos en células de GBM y/o potenciaría el efecto de la TMZ. La transfección de siRNA mediada por AMC6 demostró ser eficiente al silenciar ampliamente p42-MAPK, p44-MAPK y Rheb en células de glioma GL261 y T98G, y también MGMT en células T98G. Solamente aparecieron unos muy reducidos efectos tóxicos cuando cualquiera de estos siRNAs o siRNA SCR se utilizaron a una concentración de 100 nM.
Con respecto a los efectos producidos por TMZ, todas las líneas celulares de glioma aquí utilizadas respondieron muy pobremente a la TMZ. Solamente a concentraciones muy elevadas se detectó alguna toxicidad significativa. Cuando los nanoplejos AMC6:siRNA fueron utilizados junto con TMZ, describimos una clara potenciación de la toxicidad en algunos casos. En particular, en células GL261, la toxicidad de la TMZ fue potenciada al silenciar p42-MAPK sola o combinada con p44-MAPK o Rheb. En cuanto a las células T98G, se obtuvo potenciación con combinaciones del siRNA p42-MAPK más p44-MAPK y/o Rheb y/o MGMT. Los mejores resultados se obtuvieron al silenciar simultáneamente p42-MAPK, p44-MAPK y Rheb, o p42-MAPK, Rheb y MGMT, incrementando de 1.5 a 3.3 veces la muerte celular inducida por TMZ. En conjunto, estos resultados sugieren que la toxicidad ejercida por la TMZ puede ser potenciada en líneas celulares de GBM al silenciar distintas proteínas y combinaciones de ellas, por tanto alterando distintas vías celulares. Adicionalmente, un papel particularmente relevante en la respuesta a las TMZ parece recaer en la vía de las MAPK, dados los resultados que involucran el silenciamiento de p42-MAPK y p44-MAPK.
Se llevaron a cabo experimentos preliminares in vivo en ratones para caracterizar la biodistribución de AMC6 y de los nanoplejos AMC6: siRNA. Estos mostraron ausencia de toxicidad, distribución ubicua tanto de AMC6 como del siRNA, y una evidente acumulación en el hígado, que decayó con el tiempo. Su presencia fue asimismo confirmada en los riñones, el bazo, el corazón y el cerebro. Cuando una versión de AMC6 decorada con transferrina (Tf) se empleó en su lugar, se observó un perfil de distribución ligeramente diferente, con un aumento de su presencia en el cerebro (alrededor de +240 %).
Considerados en su conjunto, los resultados de esta tesis sugieren un enorme potencial para AMC6 como un vector para transfección de siRNA. Los nanoplejos AMC6:siRNA específicos pueden ser una valiosa alternativa terapéutica para el GBM en el futuro. Por tanto, se debe realizar más investigación para obtener una mayor información sobre su toxicidad y su perfil de biodistribución, así como sobre sus efectos en tumores in vivo.
