Microphthalmia-associated transcription factor function and regulation in kit oncogenic pathologies
- Autores: Maria Elizabeth Proaño Perez
- Directores de la Tesis: Margarita Martín Andorra (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2022
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Rosa Aligué Alemany (presid.), Meritxell Gironella Cos (secret.), Águeda Martínez Barriocanal (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina por la Universidad de Barcelona
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
KIT (CD117), es expresado en progenitores hematopoyéticos, melanocitos, células germinales, mastocitos y células intersticiales de Cajal (ICC) del tracto digestivo. La actividad quinasa de KIT ha sido asociada a tumores gastrointestinales, mastocitosis, seminoma testicular, melanoma, leucemia mieloide aguda, etc. Mutaciones de KIT en GIST (Gastrointestinal stromal tumors) producen resistencia a la primera línea de tratamiento como los TKI (inhibidores de tirosin quinasa), por lo que se ha convertido en un desafío encontrar nuevas estrategias y dianas terapéuticas en el tratamiento de estos procesos tumorales. Nuestro grupo ha reportado que el silenciamiento de 3BP2 en las líneas celulares de KIT oncogénico HMC-1(Human Mast cells) y GIST afectan a la supervivencia celular, esto conduce a una reducción de la expresión de KIT a nivel transcripcional, y una reducción de MITF (microphthalmia-associated transcription factor) a nivel postranscripcional; sugiriendo que el silenciamiento podría actuar regulando miRNAs y así afectar la expresión de MITF.
Mediante un miRNA array en modelos de GIST donde se silenció SH3BP2, se determinaron 4 miRNAs que podían regular MITF de forma predictiva; miR-1246 y miR-5100 fueron validados, su sobreexpresión afectó la viabilidad en GIST. Estos miRNAs afectaron dianas de MITF como BCL2 y CDK2. MITF ha sido ampliamente estudiado en melanoma y es capaz de coordinar varios procesos biológicos entre estos la supervivencia celular, diferenciación, proliferación, invasión, senescencia, metabolismo y reparación de daños de ADN.
Para establecer la importancia de MITF en modelos celulares de GIST, se analizó el silenciamiento mediante shRNA-MITF. EL silenciamiento afectó la supervivencia y proliferación celular la que se corroboró al verificar la expresión de BCL2, CDK2 y ETV1, el factor de transcripción ampliamente estudiado en GIST. Indicando que la actividad de MITF es importante para el crecimiento tumoral in vivo e in vitro.
El inhibidor de MITF ML329 (CID 12387471/ML329) actúa sobre el promotor TRPM-1 disminuye la expresión de MITF y sus dianas tales como CDK2 en diferentes líneas celulares que expresan MITF. En nuestro estudio observamos que el tratamiento con ML329 en GIST afecta al crecimiento tumoral in vivo e in vitro. ML329 conduce a la inhibición de supervivencia y esta es concomitante con una baja expresión de BCL2 y KIT; al igual que las alteraciones de arresto del ciclo celular y la baja expresión de CDK2 después del tratamiento con ML329.
El análisis de Secuenciación de Inmunoprecipitación de Cromatina, ChIP-seq, nos permitió identificar importantes genes dianas de MITF los cuales regulan biogénesis de lisosomas y endolisosomas; vía de señalización de mTOR y autofagia. La sobreexpresión de MITF induce a un incremento de LC3II y, el silenciamiento de MITF afecta la formación de auto fagosomas y auto-lisosomas que son indicadores del flujo de autofagia; así se demuestra que MITF es crucial en respuesta al estrés celular producido por falta de nutrientes en GIST.
GIST produce EVs (Extracellular vesicles) importantes para el mantenimiento de la patología oncogénica e inducción de metástasis. Un análisis de proteómica en las EVs obtenidas mediante SEC (size exclusion chromatography) tras el silenciamiento de MITF demostró la disminución de la expresión de KIT oncogénico y de otras proteínas como ANKRD50, CDK5, VCAN, y ZFYVE16 que son transportadas en las EVs y están involucradas en procesos de ciclo celular, metástasis y supervivencia celular.
El análisis de transcriptoma determinó las alteraciones producidas en el genotipo de GIST cuando MITF es silenciado. Los genes afectados regulan vías importantes en crecimiento tumoral, metástasis, apoptosis, y ciclo celular. Entre otras vías importantes están las que controlan procesos tumorales, donde juegan un papel primordial los genes GADD45A, Bcl2l2- Pabpn1, DACH1, y FYN. De esta forma demostramos que MITF es una diana clave en los procesos de carcinoma y debería ser profundamente estudiada.
Es importante señalar que para reforzar nuestros hallazgos la validación de miR-1246 y miR-5100, sobreexpresión de miRNAs, al igual que el silenciamiento de MITF, y el tratamiento del inhibidor ML329 también se realizó en líneas celulares de Mastocitosis HMC-1. Obteniendo resultados similares en la afectación de la proliferación y viabilidad celular. En conjunto podemos concluir que MITF cumple un rol primordial en la supervivencia y proliferación celular en modelos celulares de KIT oncogénico.
