Isolation, culture and characterization of klinefelter spermatogonial stem cells
- Autores: Guillermo Galdón López
- Directores de la Tesis: Homman Sadri Ardekani (dir. tes.), Ricardo Álvarez-Vijande García (tut. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2023
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Stefan Schlatt (presid.), Saturnino Luján Marco (secret.), Cristina Eguizabal Argaiz (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Medicina e Investigación Traslacional por la Universidad de Barcelona
- Materias:
- Texto completo no disponible (Saber más ...)
- Resumen
Introducción: El síndrome de Klinefelter (SK) es una alteración cromosómica que afecta aproximadamente a 1 de cada 500-1000 nacidos varones. Su cariotipo más frecuente es 47XXY y hasta un 10% de ellos presentan mosaicismo significativo en el estudio de sangre periférica. En la mayoría de casos, los pacientes SK permanecen asintomáticos hasta la edad adulta cuando la infertilidad masculina orienta al diagnóstico. Se ha descrito una pérdida progresiva de células germinales que se acelera durante la pubertad hasta establecer una fibrosis testicular extensa dejando a más del 90% de los pacientes azoospérmicos.
Según la literatura actual, aproximadamente 8% de los pacientes SK presentan espermatozoides funcionales en el eyaculado, dando lugar a descendencia euploide y sana mediante concepción natural o terapias de fertilidad avanzada. En los pacientes SK azoospérmicos, se han descrito focos aislados de tejido testicular con espermatogénesis preservada por lo que la biopsia testicular se ha establecido como tratamiento de elección. No obstante, la tasa de éxito para la extracción de espermatozoides en pacientes SK permanece por debajo del 50% y las probabilidades de conseguir un recién nacido sano se encuentra alrededor del 15%.
Incluso en pacientes SK sin espermatozoides viables en biopsia testicular, el análisis anatomopatológico de las muestras ha descrito la presencia de espermatogonias indiferenciadas. Las células madre espermatogoniales (SSC) son una pequeña población de espermatogonias especialmente indiferenciadas presentes en la membrana basal de los túbulos seminíferos. Las SSC tienen tanto la capacidad para la propia autorenovación así como para la diferenciación hacia la espermatogénesis, manteniendo el equilibrio de los túbulos seminíferos. A su vez, la cualidad más característica atribuida a las SSC es la capacidad para migrar hasta la membrana basal de túbulos seminíferos de sujetos azoospérmicos y reestablecer la espermatogénesis.
Se ha postulado que las SSC podrían ser utilizadas en nuevas terapias de fertilidad experimentales para pacientes SK sin espermatozoides disponibles en biopsias testiculares. Dentro de esta nueva generación de técnicas de fertilidad avanzada experimentales se incluyen: trasplante de SSC, espermatogénesis in vitro, maduración ex vivo de tejido testicular e injerto de tejido testicular. Todas ellas han mostrado resultados prometedores en modelos animales, así como en estudios preclínicos y se encuentran a diferentes niveles de desarrollo hacia la aplicabilidad clínica.
Un aspecto esencial de cualquier tratamiento de fertilidad es el valor del uso de material autólogo del paciente a fin de transmitir su material genético a su descendencia. La mayoría de las terapias experimentales basadas en SSC previamente mencionadas requieren un número significativo de células para ser viables. Algunos investigadores han logrado propagar in vitro células testiculares euploides de roedores y humanos manteniendo las características propias de una putativa población de SSC.
No obstante, se desconoce si estas técnicas serían reproducibles en sujetos aneuploides como SK.
Hipótesis: Nuestra hipótesis es que los actuales métodos de aislamiento y propagación in vitro de células testiculares podría ser adaptado a las necesidades específicas del tejido testicular de ratones y humanos con SK.
Organoides testiculares formados a partir de células testiculares SK podrían aportar conocimiento sobre la fisiopatología del SK. Los organoides testiculares podrían también suponer un avance hacia nuevas terapias de fertilidad para pacientes SK.
Objetivos: Me gustaría proponer un proyecto de tesis doctoral alrededor de los siguientes objetivos: 1. Aislar, propagar y caracterizar células testiculares procedentes de ratones XXY, incluida una población de putativas SSC.
2. Aislar, propagar y caracterizar células testiculares procedentes de humanos XXY, incluida una población de putativas SSC.
3. Formar organoides testiculares en 3D a partir de células testiculares humanas XXY y evaluar su potencial como modelo de SK in vitro; y como herramienta para la espermatogénesis in vitro.
Métodos: El método de aislamiento y cultivo de células testiculares descrito previamente para tejido humano adulto y prepuberal fue adaptado para tejido SK peripuberal de ratón y humano hasta conseguir su propagación consistente, como se describe en los artículos correspondientes. A su vez, el método de formación y diferenciación de organoides testiculares previamente descrito por nuestro grupo fue optimizado.
Algunas de las más significativas variaciones del protocolo identificadas como beneficiosas durante el proceso son: La transición de una digestión enzimática basada en la combinación de hialuronidasa, coleganasa, tripsina y DNAsa a una combinación de colagenasa (SERVA, aprobada por la FDA para ser aplicada en humanos) y DNAsa, manteniendo buena eficacia durante el proceso.
Diferentes medios de cultivo fueron comparados hasta describir una nueva variante de StemPro Complete especialmente enriquecida en FBS a la que hemos dado el nombre de Gonomedia y que en nuestra experiencia estimula la propagación inicial de células testiculares inmaduras.
En cuanto a la formación de organoides testiculares 3D, pasamos de un sistema de cultivo hanging drop a placas de cultivo ultrantiadherentes y añadiendo centrifugación tras la siembra para facilitar la formación de organoides. Se estableció 10.000 células testiculares por organoide como una medida adecuada para evitar necrosis del núcleo a lo largo del cultivo manteniendo un alto número de células resultantes.
Resultados: En el primer artículo se reportan células testiculares del modelo murino SK siendo satisfactoriamente aisladas y propagadas en cultivo hasta incrementar más de 109 veces su número. Estos resultados son comparables a los obtenidos en controles XY de la misma camada. La posterior caracterización de las células mediante RT-qPCR y dPCR identificó en cultivo los cuatro principales tipos celulares esperados en el tejido tescticular: espermatogonias, células de Leydig, células de Sertoli y células peritubulares. A su vez, mediante citometría de flujo se caracterizó una población de putativas SSC presente a lo largo de todo el tiempo en cultivo. Se realizó hibridación in situ fluorescente (FISH) de las células en cultivo observando mosaicismo presente a lo largo de cultivo e identificándose células XXY, XX y XY tanto estacionarias como en división.
En el segundo artículo se presentan los resultados obtenidos del aislamiento y cultivo de células testiculares humanas de pacientes SK peripuberales. El tejido testicular fue cedido por pacientes incluidos en el proyecto de criobanco experimental de tejido testicular de pacientes en riesgo de infertilidad masculina del Wake Forest Baptist Medical Center. El número de células experimentó un crecimiento exponencial durante 90 días en cultivo hasta alcanzar más de 109 veces su número original. La expresión génica de las células en cultivo mostró rasgos característicos propios de espermatogonias indiferenciadas, células de Leydig, células de Sertoli y células peritubulares. Mediante RNAseq para células individuales se pudo identificar un agregado células con un perfil de expresión génica superponible la descripción actual de SSC humana. La presencia de una putativa población de SSC en cultivo fue a su vez identificada mediante citometría de flujo a lo largo del tiempo de cultivo.
Cariotipado molecular de las células en cultivo fue realizado mediante secuenciación genómica de nueva generación (NGS) describiendo una población homogénea 47 XXY con un filtro de confianza del 10%. A continuación, se caracterizaron los cromosomas sexuales de las células en cultivo mediante hibridación in situ fluorescente (FISH). Los resultados identificaron de nuevo mosaicismo presente a lo largo de cultivo e identificándose células XXY, XX y XY tanto estacionarias como en división. Al enriquecer la población de espermatogonias mediante marcadores magnéticos anti- CD9, la proporción de células euploides se vio incrementada. Al observar estos resultados, se realizó un análisis FISH en las secciones histológicas tejido testicular utilizado en el estudio. Los resultados demostraron la presencia de mosaicismo minoritario intratesticular a pesar de haber sido clínicamente diagnosticados como 47, XXY no mosaicos, mediante cariotipo sobre sangre periférica.
Por último, a partir de las células testiculares de pacientes SK aisladas y propagadas in vitro en el apartado anterior se crearon organoides testiculares para su cultivo en medio 3D. Durante 23 días en cultivo (2 días de formación y 21 días de diferenciación) los organoides permanecieron viables, sin signos de necrosis y produciendo ATP.
Histológicamente los organoides presentaban un aspecto compacto con multitud de núcleos celulares repartidos tanto en la superficie como en el núcleo. No se apreciaron significativos signos de fibrosis. Para evaluar la capacidad de los organoides de reproducir in vitro la fisiología testicular se evaluaron sus dos principales funciones: la esteroidogénesis y la espermatogénesis semanalmente durante los 21 días de cultivo en media de diferenciación. En cuanto la producción de testosterona, los organoides produjeron cantidades analíticamente relevantes a lo largo de su tiempo en cultivo. No se observó una diferencia significativa en la producción de testosterona en aquellos organoides testiculares SK sometidos a estimulación de pulsos de gonadotropina coriónica humana(hCG), a diferencia de lo observado en organoides testiculares de pacientes adultos o prepuberales euploides. Para valorar la espermatogenesis sustentada in vitro, se evaluó la evolución de la expresión génica. Inicialmente, la expresión de marcadores spermatogenesis intermedia (SYCP3) y tardía (Acrosina y PRM1) eran indetectables. Tras 1 semana en cultivo de diferenciación la expresión de SYCP3 se positivizó mostrando un pico significativo que decreció posteriormente. En cambios, marcadores de espermatogénesis tardía como Acrosina y PRM1 aumentaron significativamente su expresión tan solo en la tercera semanas en cultivo. Mediante PCR digital se estimó que el porcentaje de células del organoide expresando Acrosina y PRM1 era del 0.2%.
Finalmente se realizó análisis de la dotación cromosómica de las células conformando los organoides mediante tinción FISH para los cromosomas X, Y y 18. No se apreciaron células haploides al inicio del estudio ni tras 1 o 2 semanas en cultivo. No obstante, tras 3 semanas en cultivo, células haploides tanto 18X como 18Y eran distinguibles en el núcleo de los organoides testiculares. Tras contabilizar estas poblaciones se pudo estimar que el 10.9% de las células era X/18 y el 4.6% Y/18.
Conclusiones: Este es el primer registro del que tenemos conocimiento sobre propagación in vitro de células testiculares procedentes de sujetos SK. Supone un paso crucial y necesario hacia el desarrollo de nuevas terapias de fertilidad en pacientes azoospermicos, incluidos SK.
En términos cuantitativos los resultados de propagación obtenidos son suficientes para potencialmente permitir su aplicación a la práctica clínica mediante trasplante de SSC o espermatogénesis in vitro.
No obstante, la confirmación definitiva del éxito de este sistema de cultivo celular será la eficacia con la que células propagadas in vitro son potencialmente capaces de restituir espermatogénesis en túbulos seminíferos inactivos. Para ello, nuevos estudios de seguridad y eficacia clínica son necesarios hasta que suponga razonable su aplicación experimental en pacientes.
El mosaicismo intratesticular observado en pacientes SK sin signos de mosaicismo en sangre periférica confirma la sospecha de mosaicismo tejido-específico postulada en estudios previos. A su vez, podría representar una plausible explicación para los focos de actividad espermatogénica remanentes en adultos SK azoospérmicos.
Por otra parte, la observación de que las células euploides en cultivo son preferentemente espermatogonias concuerda con el hallazgo clínico documentado de gametos intratesticulares SK mayoritariamente euploides. De este modo, se afianza la importancia de desarrollar nuevas terapias de fertilidad para pacientes SK ya que pueden dar lugar a descendencia sana.
En cuanto a los organoides testiculares, el hecho de que reproduzcan adecuadamente la esteroidogenesis y espermatogénesis in vitro confirman su valor como herramienta de recreación de la fisiología testicular y su aplicabilidad a estudio de toxicidad o exploración farmacológica.
La falta de respuesta a la estimulación con pulsos de hCG de los organoides SK arrojaría nuevos datos sobre los mecanismos fisiopatológicos del SK y apoyaría las expectativas de su uso como modelo de enfermedad.
En cuanto a la espermatogénesis, el hallazgo de células haploides tras tres semanas de cultivo de diferenciación supone un gran avance hacia la espermatogénesis in vitro como terapia experimental de fertilidad. Estudios posteriores deberán evaluar el potencial de fertilización y la viabilidad de los embriones resultantes obtenidos a partir de gámetos desarrollados in vitro.
