Resumen de Metabolismo del hierro y de la serotonina en la enfermedad del hígado graso no alcohólica
- español
Hipótesis y objetivos: La enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) es la enfermedad hepática más frecuente en el mundo occidental y posee un espectro histológico amplio que puede progresar de esteatosis simple (ES) a esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) y, posteriormente a cirrosis y carcinoma hepatocelular. La relevancia de la EHGNA radica en que se trata de una enfermedad multisistémica. Actualmente, no existe una prueba específica que pueda predecir su progresión a la EHNA, siendo la biopsia hepática la prueba gold standard para la estadificación y clasificación de la EHGNA. Dado que no se dispone de un tratamiento específico aprovado, se necesita ampliar el estudio de las vías fisiopatológicas implicadas en su desarrollo y progresión. La hepcidina podría regular la progresión de la EHGNA y el metabolismo lipídico hepático está implicado en su patogénesis. Por otro lado, la serotonina (5-HT) liberada por las células enterocromafines del tracto gastrointestinal a la circulación sistémica parece estar relacionada con la obesidad y la diabetes mellitus tipo 2 (DM2), que son factores de riesgo de la EHGNA. Sin embargo, el papel de la 5-HT sérica, sus receptores hepáticos e intestinales en la patogenia de EHGNA es poco conocida.
Objetivo general: Estudiar algunas de las vías moleculares del metabolismo del hierro y de la 5-HT posiblemente implicadas en el desarrollo y progresión de la EHGNA, para identificar futuros objetivos terapéuticos.
Objetivos secundarios: Estudio 1-Hepcidina en obesidad mórbida y EHGNA: 1)Evaluar la relación existente entre los niveles plasmáticos de hepcidina y la presencia de EHGNA en una cohorte de mujeres obesas mórbidas con EHGNA; 2)Investigar la asociación entre la expresión hepática de los principales genes implicados en el metabolismo del hierro, la expresión de los principales genes del metabolismo lipídico hepático y su posible relación con la progresión de EHGNA. Estudio 2- Serotonina en obesidad mórbida y EHGNA: 1)Dilucidar el papel de la 5-HT en la obesidad y los grados histológicos de EHGNA; 2)Investigar si los niveles circulantes de 5-HT están relacionados con la abundancia de ARNm hepático y yeyunal de los receptores de serotonina (HTR) en una cohorte de mujeres con obesidad mórbida y EHGNA.
Pacientes, material y métodos:
1.Pacientes y procedimientos. Los estudios fueron aprobados por el Comitè d’Ètica d’Investigació Clínica, Hospital Universitari Joan XXIII de Tarragona, 23c / 2015, y todas las mujeres incluidas fueron informadas de su participación y firmaron un consentimiento informado. En los dos estudios se incluyeron mujeres caucásicas residentes en la provincia de Tarragona, que se dividieron en 2 grupos: grupo control de mujeres con un IMC comprendido entre 18 y 25 Kg/m2, y grupo de mujeres que presentaban obesidad mórbida (OM) con un IMC > 40 Kg/m2, que se sometían a cirugía bariátrica. En el primer estudio, se incluyeron 69 mujeres con OM y 49 mujeres control de peso normal. En el segundo estudio, se incluyeron 58 con OM y 26 con peso normal. Las mujeres con OM se habían sometido a una dieta hipocalórica (VLCD) los 3 meses previos a la cirugía bariátrica. La biopsia hepática se indicó en las pacientes con OM si se demostraba la existencia de criterios clínicos y bioquímicos de una posible enfermedad hepática o en caso de observarse alteraciones macroscópicas a nivel hepático durante la realización de la cirugía bariátrica laparoscópica. De tal forma, la biopsia hepática se realizó sólo en aquellos pacientes que cumplían los criterios anteriores, y con el fin de establecer la presencia de enfermedad hepática. En el estudio de la 5-HT, se obtuvieron biopsias yeyunales resultado del remanente de la cirugía metabólica programada. Los criterios de exclusión fueron los siguientes: (1) consumo de alcohol superior a 10 g/día; (2) enfermedades hepáticas distintas a EHGNA, inflamatorias, infecciosas o neoplásicas agudas o crónicas; (3) mujeres menopáusicas, gestantes o en tratamiento anticonceptivo; (4) mujeres diabéticas en tratamiento con pioglitazona, agonistas del receptor del péptido similar al glucagón ‐ 1 (GLP ‐ 1), inhibidores de la dipeptidil peptidasa ‐ 4 (DPP ‐ 4) o insulina; (5) toma de antibióticos, colestiramina o ácido ursodesoxicólico. De manera específica, en el estudio de la 5-HT se excluyeron pacientes en tratamiento antidepresivo (inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina, inhibidores de la recaptación de serotonina-norepinefrina y antidepresivos tricíclicos) y agonistas del receptor de serotonina. Tamaño de la muestra: Teniendo en cuenta la presencia de OM y aceptando un riesgo α de 0,05 y un riesgo β inferior a 0,2 en un contraste bilateral, se necesitan mínimo 25 sujetos en el grupo control (normopeso) y 36 en el grupo de estudio con OM para detectar una odds ratio mínima de 0,1. Por otro lado, al considerar la histología hepática y aceptando un riesgo α de 0,05 y un riesgo β inferior a 0,2 en un contraste bilateral, se necesitan mínimo de 19 sujetos controles (hígado normal) y 41 sujetos con EHGNA para detectar una odds ratio mínima de 0,1. Se ha utilizado la aproximación de Poisson. Mediante el software GRANMO (v7.12).
2.Metodología del laboratorio: Todos los sujetos fueron sometidos a evaluaciones físicas, antropométricas y bioquímicas. Se obtuvieron muestras de sangre de pacientes con OM y sujetos control.
2.1.Medida de los parámetros antropométricos. Se analizó el índice de masa corporal y el perímetro de cintura.
2.2.Evaluación histológica. El diagnóstico de EHGNA fue realizado según los siguientes criterios: 1) histología hepática compatible, 2) ingesta de alcohol < 10 g/día, 3) exclusión de otras causas de enfermedad hepática. De acuerdo con la histología hepática y su IMC, las pacientes fueron clasificadas en 3 grupos: grupo 1, mujeres con OM e histología HN, n = 23 y 22 respectivamente; grupo 2, mujeres con OM e histología hepática de ES, n = 22 y 21 respectivamente; grupo 3, mujeres con OM e histología hepática de EHNA, 24 y 15 respectivamente.
2.3.Determinaciones bioquímicas. Los parámetros bioquímicos se analizaron mediante un analizador automático convencional. Los parámetros del perfil férrico (incluyendo ferritina, transferrina, saturación de transferrina y niveles de hierro), se analizaron en el primer estudio. La resistencia a la insulina se estimó utilizando la evaluación del modelo homeostático 2-resistencia a la insulina (HOMA2-IR). Las concentraciones plasmáticas de hepcidina y 5-HT, se midieron mediante un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Las citocinas como interleuquina (IL) ‐ 1, IL ‐ 6, IL ‐ 8, TNF ‐ α y adiponectina se determinaron mediante inmunoensayos sándwich multiplex en el Centro de Ciencias Ómicas (Universitat Rovira i Virgili) según las instrucciones del fabricante. Todas las moléculas se midieron en muestras de suero.
2.4.Extracción de ARN y reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real. Las muestras de hígado y yeyuno recogidas durante la cirugía bariátrica se conservaron en RNAlater y luego se procesaron y almacenaron a -80 °C. El ARN total se extrajo de ambos tejidos utilizando el mini kit RNeasy. La transcripción inversa a ADNc se realizó con el kit de ARN a ADNc de alta capacidad. La PCR cuantitativa en tiempo real (RT ‐ qPCR) se realizó con el ensayo TaqMan prediseñado. Para la detección de hepcidina, ferroportina 1, hemojuvelina, receptor de transferrina 1 y 2, LXRA, SREBP1c, ACC1, FAS, PPARa, CPT1a, CROT, SREBP2, ABCA1, ABCG1 y ARN ribosómico 18S que se utilizó como gen de limpieza. Para la detección de HTR2A, HTR2B y HTR3 en el hígado y HTR3 y HTR4 en el yeyuno, los niveles de ARNm de cada gen se calcularon en relación con la expresión de ARN 18S para genes hepáticos y GAPDH para genes en el yeyuno, utilizando el grupo de control (hígado normal) como calibrador. Todas las reacciones se llevaron a cabo por duplicado en placas de 96 pocillos utilizando el sistema de PCR en tiempo real rápido 7900HT.
3.Estudio estadístico. Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS 23.0 para Windows. Todos los valores fueron probados para normalidad usando la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Los datos se presentan como mediana (percentil 25-percentil 75) cuando nos encontramos ante una distribución no paramétrica de las variables, o como media y desviación estándar de la muestra cuando las variables presentan una distribución paramétrica. Las diferencias entre los grupos de estudio se calcularon mediante una prueba no paramétrica: prueba U de MannWhitney y análisis de Kruskal-Wallis. La fuerza de asociación entre las variables fue analizada por las pruebas de Spearman. Se consideró que los valores de p <0,05 mostraban resultados estadísticamente significativos.
Para la elaboración de las gráficas se utilizó el software GraphPad Prism 5 y el análisis estadístico de la abundancia relativa de genes analizados se realizó mediante la prueba de Wilcoxon.
Conclusiones: 1)Los niveles de hepcidina circulante están asociados con la obesidad pero no con la presencia de EHGNA ni con la gravedad de su histología.
2) La expresión hepática de hepcidina y de sus genes reguladores relacionados con el metabolismo del hierro (receptor de transferrina 1 (TfR1) y 2 (TfR2) y la ferroportina 1 (FPN1) parecen desempeñar un papel en la regulación de las vías del metabolismo de los lípidos en el hígado o quizás compartir un mecanismo patogénico común, lo que podría tener implicaciones en la patogénesis de la EHGNA. Serían necesarios más estudios para confirmar y aclarar estos hallazgos.
3)La expresión hepática de hepcidina, HJV, FPN1, TfR1 y TfR2 se asocia con la expresión hepática de genes relacionados con el metabolismo de los lípidos implicados en la síntesis de novo de ácidos grasos (LXRα y SREBP1c), la oxidación de ácidos grasos (PPARα), la secreción de lipoproteínas (ABCG1) y la triacilglicerol lipasa, PNPLA3.
5) Los niveles de serotonina (5-HT) periférica están disminuidos en mujeres con OM bajo una dieta hipocalórica.
6)La correlación negativa entre los niveles de 5-HT y los criterios del síndrome metabólico (SMet)podrían sugerir un efecto protector sobre la obesidad y/o el SMet.
7)Existe una desregulación de la expresión de ARNm de HTR2A y HTR2B hepáticos en mujeres con obesidad mórbida y EHGNA, lo que podría sugerir una nueva diana terapéutica.
8)La modulación del metabolismo del hierro y de la 5-HT podrían representar un nuevo enfoque terapéutico en la obesidad y la EHGNA.
- català
Treball basat en l'estudi del metabolisme del ferro i de la serotonina (5-HT), potencialment implicats en el desenvolupament i la progressió de la malaltia del fetge gras no alcohòlic (MFGNA). La MFGNA ha esdevingut la causa més freqüent de malaltia hepàtica, de la mà de l'obesitat i de la síndrome metabòlica. A la fisiopatologia de la MFGNA sembla intervenir el metabolisme del ferro, mitjançant l'hepcidina (HEPC) i possiblement el de la 5-HT. El coneixement d'aquestes vies a la MFGNA és escàs, motiu pel qual es van realitzar dos estudis en dones obeses mòrbides (OM) amb EHGNA. D'una banda, es van analitzar els nivells plasmàtics de HEPC que es van mostrar associats amb l'obesitat però no amb la presència de MFGNA ni amb la gravetat histològica. De l'altra, es va estudiar l'associació entre l'expressió hepàtica d’HEPC i dels seus gens reguladors implicats en el metabolisme fèrric i l'expressió dels principals gens del metabolisme lipídic hepàtic i es va evidenciar una relació clara entre tots dos possiblement per compartir un mecanisme patogènic comú. Al segon estudi, es van analitzar els nivells plasmàtics de 5-HT i es va observar que estan disminuïts en pacients amb OM sota dieta hipocalòrica i que la 5-HT podria tenir un efecte protector en l'obesitat i la síndrome metabòlica. A més, es va investigar l'expressió d'ARNm hepàtic i ejunal dels receptors de serotonina (HTR) i es va objectivar que hi ha una desregulació de HTR2A i HTR2B hepàtics en dones amb OM i EHGNA. No es van trobar diferències significatives en els nivells d’expressió jejunal de HTR3 i HTR4 segons la presència de MFGNA. Tot i que calen més estudis, la modulació del metabolisme del ferro i de la 5-HT podrien representar futurs objectius terapèutics en l'obesitat i la MFGNA.
- English
This work is based on the study of the metabolism of iron and serotonin (5-HT), potentially involved in the development and progression of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). NAFLD has become the most common cause of liver disease, along with obesity and the metabolic syndrome. Iron metabolism, through hepcidin (HEPC) and possibly 5-HT seem to intervene in the pathophysiology of NAFLD. The knowledge of these pathways in NAFLD is scarce. In this sense, two studies were conducted in morbidly obese women (MO) with NAFLD. On the one hand, plasma levels of HEPC were analyzed and it was shown that they are associated with obesity but not with the presence of NAFLD or with histological severity. On the other hand, the association between the hepatic expression of HEPC and its regulatory genes involved in iron metabolism and the expression of the main genes of hepatic lipid metabolism was studied, and a clear relationship between them was evidenced, possibly because they share a common pathogenic mechanism. In the second study, plasma levels of 5-HT were analyzed and it was observed that they are decreased in patients with MO on a hypocaloric diet and that 5-HT could have a protective effect on obesity and metabolic syndrome. In addition, the expression of hepatic and jejunal mRNA of serotonin receptors (HTR) was investigated and it was observed that there is a deregulation of hepatic HTR2A and HTR2B in women with MO and NAFLD. No significant differences were found in the jejunal expression levels of HTR3 and HTR4 according to the presence of NAFLD. Although more studies are needed, modulation of iron and 5-HT metabolism could represent future therapeutic targets in obesity and NAFLD.
