Structural genomic alterations in hepatocellular carcinoma and novel combination therapies
- Autores: Roger Esteban Fabro
- Directores de la Tesis: Josep Maria Llovet i Bayer (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2023
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Manel Esteller Badosa (presid.), Beatriz Mínguez Rosique (secret.), Anja Lachenmayer (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Medicina e Investigación Traslacional por la Universidad de Barcelona
- Materias:
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- Resumen
Título Alteraciones somáticas estructurales en carcinoma hepatocelular y nuevas terapias de combinación.
Introducción El cáncer de hígado es el sexto tipo de cáncer más diagnosticado en el mundo y la tercera causa de muerte asociada a cáncer[1]. Un 90% de los casos corresponden al carcinoma hepatocelular (CHC), que normalmente ocurre en el contexto de una enfermedad hepática crónica[2]. De todos los pacientes de CHC, un 50-60% están expuestos a terapias sistémicas a lo largo de su vida. Recientemente, la combinación de la inmunoterapia atezolizumab (anticuerpo monoclonal contra PD-L1, que permite desencadenar una respuesta inmune antitumoral) con bevacizumab (anticuerpo monoclonal contra VEGF, un factor de crecimiento responsable de la angiogénesis o formación de nuevos vasos sanguíneos) se ha convertido en el standard of care en primera línea en CHC avanzado. Aun así, sólo un 30% de los pacientes responden a este tratamiento y la supervivencia media de les pacientes tratados es inferior a los dos años[3]. Por tanto, es necesario descubrir biomarcadores de respuesta o resistencia y profundizar en el conocimiento sobre los mecanismos de la inmunidad antitumoral para mejorar las opciones terapéuticas de los pacientes. De hecho, los tumores desarrollan mecanismos para evadir la respuesta inmune, entre otros acumulan alteraciones genómicas que enmascaran y evitan el ataque inmune. La aneuploidía es un tipo de alteración derivada de la inestabilidad de los cromosomas que altera el número de copias de los genes, pero su impacto biológico en CHC no se ha descrito detalladamente [4,5].
La elevada tasa de resistencia primaria a atezolizumab-bevacizumab (70%) resalta la necesidad de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas[2]. Dado que las inmunoterapias muestran mejores resultados en tumores con un contexto proinflamatorio[6] y que las moléculas proangiogénicas son inmunosupresoras, la actividad antitumoral de la inmunoterapia podría ser estimulada promoviendo la infiltración o reactivación de las células inmunes mediante terapias de combinación con agentes antiangiogénicos[7]. En este contexto, el inhibidor de receptores tirosina quinasa cabozantinib es un candidato prometedor.
En países occidentales, los incrementos en la incidencia de la obesidad y el síndrome metabólico están conduciendo a un aumento en los casos de CHC atribuibles a la esteatohepatitis no alcohólica (NASH), una enfermedad hepática crónica debida a la inflamación en un hígado graso[2,8]. Recientemente, los tumores de NASH-CHC se han descrito como menos sensibles a la inmunoterapia debido a la expansión de un subgrupo de linfocitos infiltrantes con un perfil disfuncional [9]. Por otro lado, los neutrófilos son otro tipo de célula inmune que presenta un comportamiento plástico y puede actuar a favor o en contra de lkos tumores [10]. Por tanto, la modulación de su comportamiento podría ser un mecanismo para superar la resistencia a la inmunoterapia asociada a NASH-CHC.
Hipótesis La hipótesis de esta tesis es que la identificación de rasgos moleculares asociados a la inmunidad antitumoral en el carcinoma hepatocelular y la evaluación de nuevas terapias de combinación con inmunoterapia revelarán biomarcadores candidatos de respuesta o resistencia a la inmunoterapia y opciones terapéuticas más efectivas para estimular la respuesta inmunitaria antitumoral.
Objetivos Los objetivos específicos de esta tesis doctoral son: 1. Determinar el impacto biológico y clínico de la inestabilidad cromosómica en carcinoma hepatocelular y revelar su asociación con la inmunidad antitumoral.
2. Evaluar el impacto de las terapias moleculares combinadas con la inmunoterapia en modelos preclínicos de carcinoma hepatocelular. Específicamente: 2.1. Explorar los efectos antitumorales e inmunomoduladores de cabozantinib en monoterapia y en combinación con anti-PD1.
2.2. Evaluar la capacidad de un inhibidor de CXCR2 para re-sensibilizar a la terapia con anti-PD1 el CHC asociado a esteatohepatitis no alcohólica (NASH).
Métodos Estudio #1 (Bassaganyas et al., Clin Caner Res 2020): Se analizaron los datos de SNParray de 452 pares de muestras de tejido tumoral y de hígado adyacente de pacientes con CHC, así como 25 nódulos displásticos. Para cuantificar las cargas genómicas en alteraciones en el número de copias amplias y focales se utilizó la herramienta web CNApp [11], que permite extraer broad y focal scores (BS y FS), respectivamente. A continuación, estos se integraron con los perfiles transcriptómicos, mutacionales y de metilación de las muestras, con su composición inmune y con datos clinicopatológicos.
Estudio #2 (Esteban-Fabró et al., Clin Cancer Res 2022): Se utilizaron dos modelos murinos singénicos de CHC basados en la inyección subcutánea de las líneas celulares Hepa1-6 y Hep53.4 (n=80 y 40, respectivamente). Los animales se aleatorizaron entre los grupos experimentales cabozantinib, anti-PD1, la combinación o placebo. Las muestras tumorales de los modelos se evaluaron mediante citometría de flujo, inmunohistoquímica y análisis transcriptómico. A su vez, se extrajo sangre que se evaluó mediante citometría de flujo y un panel de citoquinas. Los efectos observados con cabozantinib se validaron con los datos transcriptómicos de un modelo de xenograft derivado de tumores colorrectales. Finalmente, los datos transcriptómicos de tres cohortes de pacientes de CHC (cohorte 1: n=167, cohorte 2: n=57, The Cancer Genome Atlas: n=319) permitieron clusterizar los pacientes según perfiles de expresión similares a los animales tratados con la combinación, y se evaluó su valor pronóstico.
Estudio #3 (Leslie et al., Gut 2022): Se caracterizó la infiltración de neutrófilos en CHC humano y en tres modelos de NASH-CHC: modelo ortotópico sobre hígado con NASH, modelo DEN-ALIOS y modelo deficiente en colina y con dieta rica en grasas. En los dos primeros modelos se administró anti-PD1, un inhibidor de CXCR2 (AZD5069), la combinación o vehículo. Los efectos moleculares de las terapias sobre el microambiente tumoral fueron evaluados mediante imaging mass cytometry, secuenciación de ARN y citometría de flujo. Además, se administró anti-CD8a para reducir las células T CD8+, ratones iCCR (knockout de CCR1, 2, 3 y 5) para impedir el reclutamiento de células dendríticas (CDs), anti-XCL1 para bloquear la interacción entre CDs y células T CD8+, y las transfusiones de neutrófilos inmaduros permitieron evaluar su capacidad antitumoral.
Resultados Estudio #1 (Bassaganyas et al., Clin Cancer Res 2020): 1. A nivel pan-cáncer, las distribuciones de BS y FS en CHC son intermedias. El CHC es uno de los 14 tipos tumorales de la cohorte de TCGA donde el BS se correlaciona negativamente con el infiltrado inmunitario.
2. Los CHCs con baja carga de CNAs amplias (BS bajo) son más diploides y enriquecidos en la clase inmune del CHC, específicamente la subclase inmune activa.
Presentan más señalización antitumoral, infiltrado inmune y actividad citolítica, y son transcriptómicamente similares a los tumores que responden a anti-PD1.
3. Los CHCs con alta carga de CNAs amplias (BS alto) son más poliploides y están enriquecidos en procesos de proliferación y de reparación del ADN, y presentan una baja infiltración inmunitaria.
4. Altos niveles de CNAs focales (FS alto) se asocian con rasgos clásicos de proliferación, mutaciones en TP53, firmas moleculares de mala prognosis y rasgos de tumores agresivos con pobre diferenciación e invasión vascular. FS no se asoció con ningún perfil inmune.
5. Los nódulos displásticos i CHCs incipientes que presentan alguna CNA amplia también se asocian con la falta de perfiles de actividad inmune antitumoral.
6. Se observaron distintos mecanismos que podrían justificar las asociaciones entre la acumulación de CNAs amplias y una reducción en los perfiles inmunitarios: a. Los tumores con bajos BS presentan una mayor proporción de neoantígenos observados respecto los esperados según su carga mutacional.
b. Los CHCs con BS altos presentan deleciones específicas en genes de la maquinaria de presentación antigénica (como HLA-DQB1).
c. Los valores de BS altos se asocian con una hipometilación general, hecho que podría indicar una influencia epigenética en los perfiles inmunes del CHC.
d. La acumulación de deleciones amplias se asocia con un menor infiltrado inmune en mayor medida que las ampliaciones.
Estudio #2 (Esteban-Fabró et al., Clin Cancer Res 2022): 1. La combinación de cabozantinib con anti-PD1 resultó en una reducción significativa del tiempo hasta respuesta objetiva versus el resto de tratamientos, induciendo a la vez la mayor inhibición del crecimiento tumoral y la mayor tasa de respondedores. Tanto cabozantinib como la combinación causaron una reducción significativa en el volumen tumoral viable y un aumento en la tasa de necrosis tumoral.
2. Los efectos antiangiogénicos de cabozantinib y de la combinación se confirmaron con una reducción observada en la tinción de CD31, la ausencia de vasos encapsulando clústeres tumorales, una reducción en firmas transcriptómicas de angiogénesis y un enriquecimiento en firmas de hipoxia. La combinación también se asocia con la mayor reducción en firmas de proliferación y reparación del ADN.
3. La evaluación de las poblaciones infiltrantes al tumor reveló que cabozantinib y la combinación indujeron un reclutamiento significativo de neutrófilos (resultantes de citometría de flujo, inmunohistoquímica y análisis transcriptómico). Además, la actividad de los neutrófilos fue el proceso más significativamente asociado con los 100 genes sobreexpresados únicamente por la combinación.
4. Adicionalmente, la totalidad de los tumores tratados con anti-PD1 y la combinación recapitularon la clase inmune del CHC. La combinación se asoció significativamente con el enriquecimiento en firmas de expresión de inflamación, inmunidad innata y adaptativa y la reducción de vías de señalización de TGF-¿ y ¿- catenina. Tanto cabozantinib como la combinación causaron una reducción en la infiltración de linfocitos T CD8+ PD1+ y de células T reguladoras.
5. A nivel sistémico, cabozantinib y la combinación aumentaron las proporciones de células T y T CD8+ circulantes, y redujeron el ratio de neutrófilos/linfocitos en sangre. La combinación causó un aumento específico de las proporciones de células T y T CD8+ memoria/efectoras, y de los niveles de las quimiocinas CCL27 e IL-16.
6. Se definieron tres clústeres de CHC humano en función del enriquecimiento en la firma molecular de neutrófilos MCPCOUNTER, que correlacionó con el perfil de activación de neutrófilos en los modelos murinos. El clúster enriquecido en neutrófilos (Neutrophil Enriched, 25% de CHCs), con altos niveles de la firma en tejido adyacente y tumoral, presenta una falta de exclusión inmune, una falta de rasgos proliferativos y de células de-diferenciadas, y se asoció con una mejor prognosis.
Estudio #3 (Leslie et al., Gut 2022): 1. Se detectó una expresión de CXCR2 superior entre neutrófilos infiltrados en hígado NASH humano y en tumores NASH-HCC de pacientes, así como en modelos murinos de NASH-CHC. En los modelos murinos, los neutrófilos asociados a tumor presentaron enriquecimento en la expresión de genes inflamatorios y protumorales.
2. La resistencia de NASH-HCC a la inmunoterapia se superó mediante el cotratamiento con el inhibidor de CXCR2 AZD5069, que fue capaz de alargar la supervivencia, reducir la carga tumoral e impedir la proliferación celular de los tumores en los modelos de NASH-CHC murinos.
3. La combinación del inhibidor de CXCR2 con anti-PD1 aumentó la infiltración de células T CD8+ y la cantidad de clústeres de células T granzima B-positivas. Estos clústeres también presentaron enriquecimiento en células dendríticas convencionales (cDCs) XCR1+ y neutrófilos inmaduros proliferativos.
4. La combinación, que aumentó el número de neutrófilos infiltrantes, a su vez indujo su reprogramación hacia un perfil antitumoral: los neutrófilos tratados con la combinación presentaron un enriquecimiento en procesos de ciclo celular, fagocitosis, presentación de antígenos y desgranulación.
5. La transfusión de neutrófilos inflamatorios inmaduros en combinación con anti-PD1 tuvo un efecto antitumoral similar a la combinación con el inhibidor de CXCR2, y a su vez aumentó las células T CD8+ y las células dendríticas convencionales infiltradas. En paralelo, la reducción de las células T CD8+, CDc y el bloqueo de las interacciones entre CDc y células T CD8+ causó una reducción en la actividad antitumoral de la combinación. Por tanto, estas células son necesarias para el beneficio terapéutico de la combinación.
Conclusiones ¿ Existe una asociación diferencial entre las cargas genómicas de CNAs amplias o focales y distintos rasgos moleculares del CHC. Los CHCs con altas cargas de CNAs amplios exhiben rasgos de exclusión inmune, mientras que bajas cargas de CNAs amplios se asocian a perfiles de activación de la inmunidad antitumoral. Estos datos constituyen evidencias en favor de la inestabilidad cromosómica como rasgo diferencial del cáncer que impacta sobre la inmunogenicidad de los tumores, hecho que puede influenciar la capacidad de respuesta de los pacientes a la inmunoterapia.
¿ La combinación de cabozantinib con anti-PD1 presenta una mayor eficacia que las monoterapias y promueve la inmunidad antitumoral a través de la estimulación de una respuesta innata guiada por la infiltración de neutrófilos en combinación con una respuesta inmune adaptativa. Los CHCs humanos enriquecidos en rasgos moleculares de neutrófilos activados con la combinación presentan un perfil molecular y clínico favorable, hecho que sugiere el beneficio de esta combinación en el tratamiento del CHC.
¿ Los neutrófilos asociados a un tumor se pueden manipular selectivamente a través de la inhibición de CXCR2 para adoptar un perfil antitumoral. La combinación de un inhibidor de CXCR2 con la inmunoterapia anti-PD1 aumenta la eficacia de anti-PD1 en modelos preclínicos de NASH-CHC y es un candidato prometedor para ser avaluado en ensayos clínicos.
