Resumen de Fabrication of micro and nanostructured surfaces for directing cellular responses and inhibiting bacterial infection
María Teresa Alameda Felgueiras
Resumen Un amplio número de investigaciones ya ha demostrado que la estimulación física procedente del microentorno celular puede influir en la respuesta y la funcionalidad de las células. La noción de que los estímulos físicos sobre las células pueden ser modulados mediante la manipulación de parámetros controlables de los materiales, como la rigidez o la topografía de la superficie, también se ha investigado ampliamente para aplicaciones en medicina regenerativa.
Una de las principales estrategias abordadas por la ingeniería de biomateriales en el desarrollo de implantes protésicos es el diseño de superficies que favorezcan su biointegración, facilitando la curación y restableciendo la función de los tejidos del paciente al tiempo que previenen las infecciones bacterianas. En este sentido, las tecnologías de micro- y nanofabricación han surgido como herramientas atractivas para dotar a la superficie de los biomateriales de elementos definidos con precisión con una resolución micro- y nanométrica. Esto permite estandarizar y establecer con precisión el control de los estímulos mecánicos que rodean a la célula para, en primer lugar, comprender los mecanismos que subyacen en la percepción de las células cuando interactúan con ellos, así como las respuestas celulares que pueden desencadenar y, en última instancia, utilizarlos para dirigir el destino celular.
El objetivo general de esta tesis es abordar ambos aspectos, la mejora del proceso de biointegración y la prevención de la colonización bacteriana sobre materiales poliméricos mediante diseños superficiales micro- y nanotopográficos capaces de generar una respuesta biológica favorable por medio de la mecano-estimulación.
Con este fin se desarrolló un proceso de nanofabricación para crear topografías jerárquicas en las que convergen micro y nanoestructuras. Se eligieron diferentes formas y disposiciones microtopográficas, mientras que la nanotopografía de ojo de polilla se seleccionó por sus conocidas propiedades mecano-bactericidas. La replicación de las topografías seleccionadas se realizó con éxito en polímeros con diferente rigidez y propiedades mecánicas.
Se analizaron sustratos topográficos como plataformas regenerativas, en particular como materiales óseo-instructivos. Para ello, se realizaron estudios de biología celular con células madre mesenquimales (MSCs, por sus siglas en inglés) ¿procedentes de un tejido adiposo¿ debido a sus cualidades regenerativas (esto es, autorrenovación y potencial de diferenciación hacia múltiples linajes) en términos de proliferación celular, morfología celular, migración celular y diferenciación osteogénica.
Los resultados evidencian la influencia de las señales mecánicas y topográficas de los sustratos en el comportamiento de las MSCs. El comportamiento proliferativo de las células se ve más afectado por la topografía a medida que disminuye la rigidez del material. La proliferación celular es menor en los materiales más blandos (E~MPa) en comparación con los materiales más rígidos (E~GPa) estudiados.
Parámetros morfológicos de las células, como el área, la circularidad y la elongación, están determinados por la topografía. Se observa una clara influencia de la anisotropía de la topografía promoviendo la elongación celular. La nanotopografía, ya sea de forma aislada o en combinación jerárquica, provoca una disminución del área celular y un aumento de la circularidad celular. La propagación celular está profundamente guiada por la anisotropía de la topografía orientándose fuertemente sobre ellas, lo que a su vez condiciona la direccionalidad en el comportamiento migratorio de las células. La velocidad de migración celular también está influida tanto por la topografía como por la rigidez del material. Sin embargo, los estudios de diferenciación celular hacia el linaje osteogénico muestran que las MSCs se ven mucho más afectadas por las propiedades mecánicas del material (rigidez) que por la topografía, siendo los sustratos de mayor rigidez más osteoinductores.
Se evaluaron también las fuerzas de tracción celular mediante la combinación de imágenes transversales célula-sustrato obtenidas por microscopía electrónica de barrido con haz de iones focalizados (FIB-SEM, por sus siglas en inglés) junto con la simulación por el método de elementos finitos (FEM, por sus siglas en inglés). Los resultados indican que las microtopografías fabricadas en materiales más rígidos son mucho más resistentes a la flexión por las fuerzas de tracción celular. En cambio, cuando la relación de aspecto de la topografía aumenta, ésta muestra una menor resistencia, exhibiendo una flexión más aparente.
Se investigó el efecto bactericida de la nanotopografía de ojo de polilla -también en combinación jerárquica con microtopografías- y su dependencia de la rigidez del material. Para ello, se analizó la dinámica del proceso bactericida, así como la deformación mecánica de la pared bacteriana infligida por las topografías. A partir del momento en que se detecta el daño bacteriano, se observa que la ruptura mecánica infligida por la nanotopografía de ojo de polilla es más rápida en las bacterias grampositivas Staphylococcus aureus que en las gramnegativas Escherichia coli, especialmente cuando aumenta la rigidez de la nanotopografía. Estos hallazgos coinciden con los cálculos obtenidos mediante simulación FEM para la deformación de la pared bacteriana como resultado de la mecano-indentación producida por los nanoconos de ojo de polilla. E. coli muestra deformaciones más profundas que S. aureus, debido al comportamiento mecánico más elástico de su pared celular bacteriana. La eficacia bactericida de la nanotopografía de ojo de polilla aumenta a medida que se incrementa la rigidez del material. Las topografías en combinación jerárquica presentan una acción más temprana y fluctuante en el tiempo. Este efecto bactericida observado en las topografías jerárquicas puede atribuirse a un ¿efecto de recolección¿ de la superficie fomentado por las microestructuras que acercan las células bacterianas a la interfaz de la nanotopografía donde tiene lugar la acción bactericida. Las fluctuaciones pueden obedecer a un proceso de muerte-liberación en el que las bacterias muertas se desprenden de la superficie.
Summary A vast body of research has already demonstrated that physical stimulation arising from the cell microenvironment can impact the cell response and functionality. The notion that physical stimuli on cells can be modulated through the manipulation of controllable parameters of materials, such as stiffness or surface topography, has also been extensively investigated for applications in regenerative medicine.
One of the main strategies addressed by biomaterials engineering in the development of prosthetic implants is the design of surfaces that favor their biointegration, facilitating healing and restoring the function of the patient¿s tissues while preventing bacterial infections. In this sense, micro- and nanofabrication technologies have emerged as attractive tools for providing the surface of biomaterials with features precisely defined with micro- and nanometric resolution. This allows standardizing and precisely establishing the control of mechanical stimuli surrounding the cell to first understand the mechanisms underlying the cells¿ perception when interacting with them, as well as the cellular responses they may trigger, and ultimately use them to direct cell fate.
The overall objective of this thesis is to deal with both aspects, the improvement of the biointegration process and the prevention of bacterial colonization on polymeric materials by means of micro- and nanotopographic surface designs capable of generating a favorable biological response through mechanostimulation.
To this end, a nanofabrication process was developed to create hierarchical topographies converging micro- and nanofeatures. Different microfeatures shapes and arrangements were chosen, while the moth-eye nanotopography was selected for its well-known mechano-bactericidal properties. Replication of the topographies selected was successfully accomplished in polymers with different stiffness and mechanical properties.
Topographical substrates were tested as regenerative platforms, particularly as osseo-instructive materials. For this, cell biology studies were carried out using mesenchymal stem cells (MSCs) ¿from an adipose tissue source¿ due to their regenerative qualities (i.e., self-renewal and multilineage differentiation potential) in terms of cell proliferation, cell morphology, cell migration, and osteogenic differentiation.
The results evidence the influence of the mechanical and topographical cues of the substrates on the MSCs behavior. Cell proliferative behavior is more affected by topography as material stiffness decreased. Cell proliferation is lower in the softer materials (E~MPa) compared to the stiffer materials (E~GPa) studied.
Morphological cell parameters, such as area, circularity, and elongation, are determined by topography. A clear influence of the topography anisotropy in promoting cell elongation is observed. The nanotopography, either standalone or in hierarchical combination, leads to a decrease in cell area and an increase in cell circularity. Cell spreading is deeply guided by the anisotropy of the topography becoming strongly oriented on them, which in turn conditions the directionality in the cell migration behavior. Cell migration speed is also influenced by both topography and material stiffness. However, cell differentiation studies towards the osteogenic lineage show that MSCs are much more affected by the mechanical properties of the material (stiffness) than by the topography, being stiffer substrates more osteoinductive.
Cell traction forces were also evaluated by combining cell-substrate cross-sectional images obtained by focused ion beam scanning electron microscopy (FIB-SEM) together with simulation by the finite element method (FEM). The results indicate that the microtopographies fabricated on stiffer materials are much more resistant to bending by cell tractions forces. In contrast, when the aspect ratio of the topography increase, the topography shows lower resistance, exhibiting more apparent bending.
The bactericidal effect of moth-eye nanotopography ¿also in hierarchical combination with microtopographies¿ and its dependence on material stiffness was investigated. For this, the dynamics of the bactericidal process, as well as the mechanical deformation of the bacterial wall inflicted by the topographies were analyzed. From the moment bacterial damage is detected, the mechanical rupture inflicted by moth-eye nanotopography is found to be faster in Staphylococcus aureus gram-positive bacteria than Escherichia coli gram-negative, especially when nanotopography stiffness increased. These findings agree with the calculations obtained by FEM simulation for the deformation of the bacterial wall as a result of the mechano-indentation produced by moth-eye nanocones. E. coli show deeper deformations than S. aureus, due to the more elastic mechanical behavior of its bacterial cell wall. The bactericidal efficacy of moth-eye nanotopography is enhanced as material stiffness increases. The topographies in hierarchical combination exhibit an earlier and fluctuating action over time. This bactericidal effect observed in hierarchical topographies can be attributed to a surface ¿gathering effect¿ fostered by the microstructures bringing bacteria cells closer to the nanotopography interface where the bactericidal action takes place. The fluctuations may be ascribed to a kill-release process where the dead bacteria are released from the surface.
