Molecular mechanisms of regulation of exon definition through splicing silencers and cognate factors
- Autores: Nuria Majós Oró
- Directores de la Tesis: Juan Valcárcel Juárez (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Pompeu Fabra ( España ) en 2012
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Javier F. Cáceres (presid.), Eduardo Eyras Jimenez (secret.), María Jesus Macías Hernández (voc.), Josep Vilardell (voc.), José Ayté del Olmo (voc.)
- Materias:
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- Resumen
El procesamiento alternativo proporciona a la célula la capacidad de generar a partir de un solo gen múltiples ARN mensajeros, y es el principal contribuyente a la diversidad proteica en los eucariotas superiores. Este proceso está sujeto a regulación estricta, principalmente a través de la acción de factores que se unen a secuencias cis en el pre-ARNm y que pueden tener un efecto potenciador o un efecto represor sobre el ensamblaje de la maquinaria y el progreso de la reacción de procesamiento. El desequilibrio entre las proporciones de las distintas isoformas resultantes del proceso de procesamiento son causa común de la enfermedad.
El procesamiento del exón 6 de Fas es regulado por la combinación de los efectos de dos factores: TIA-1 y PTB. TIA-1 se une a una secuencia intrónica con carácter estimulador y refuerza la estabilización de la unión del factor U1snRNP al lugar de procesamiento 5 '(Forch et al, 2000, 2002), que hace que el factor auxiliar U2AF se una al sitio 3 'de procesamiento (3¿ss) del intrón 5 (Izquierdo et al, 2005). PTB promueve la represión del exón cuando se une a una secuencia con carácter inhibitorio situada en la región central del exón 6, e inhibe la asociación de los factores U2AF y U2 snRNP en la región 3 `ss, aunque no afecta a la unión de U1snRNP el lugar 5 '. En esta tesis hemos construido evidencia para demostrar que el reconocimiento del exón 6 responde a un proceso de definición exónica que es regulado por TIA-1 y PTB.
La proteína Raver-1 ha sido descrita como co-represora de PTB al modelo de tropomiosina (Gromak et al 2003). En esta tesis demostramos que Raver-1 mantiene esta función co-represora también en el modelo de Fas.
Nuestro objetivo ha sido entender los mecanismos moleculares a través de los cuales tiene lugar la represión por PTB y Raver-1. Hemos utilizado un sistema de reclutamiento artificial a través de la proteína MS2 para dirigir la unión de diferentes fragmentos peptídicos en la región central del exón 6 y poder definir las regiones peptídicas mínimas de estas proteínas que son responsables de la acción represora.
El análisis sistemático de mutagénesis que hemos desarrollado en esta tesis ha permitido la identificación de un motivo de 10 amino ácidos de Raver-1 con una fuerte actividad represora sobre el exón 6 de Fas. A continuación hemos fusionado dos copias del motivo y las hemos flanqueado y separado utilizando una secuencia de 8 aa. Así conseguimos generar un péptido represor mínimo que cuando se une artificialmente en la secuencia represora exónica provoca la exclusión total del exón 6. Los requerimientos de composición de amino ácidos necesarios para mediar la represión fueron definidos a través de un proceso de mutagénesis que determinó que la presencia de una cadena lateral alifática voluminosa es importante para mantener la capacidad represora. Los péptidos represores mínimos in vitro promueven la exclusión del exón 6 de Fas porque bloquean el proceso de definición del exón de una manera similar a PTB: no afectan al reclutamiento de U1snRNP al 5'ss pero alteran el reconocimiento del 3¿ss para U2AF. El análisis de los eluidos los GST-pull-downs de las versiones purificadas los péptidos de fusión a GST, tanto de las versiones represoras como los mutantes no represores, nos permitieron identificar proteínas en los extractos nucleares que se unen de manera específica a los péptidos represores.
En este trabajo de tesis también presentamos la investigación sobre una posible influencia de la presencia de regiones poli-(C)s sobreabundantes conservadas en la región intrónica subsecuente a 5 ' ss débiles sobre el reconocimiento del 5'ss por parte de U1 snRNP. Mostramos que la proteína recombinante hnRNP K se une específicamente a las secuencias de poli-(C)s in vitro y que inhibe el reclutamiento de U1 al 5¿ss. La sobrexpresión de hnRNP K in vivo causa procesamiento alternativo en minigenes reporteros que contienen secuencias de poli-(C) s mientras que no modula el procesamiento de minigenes que no contienen secuencias ricas en Cs. La deleción o mutación de las secuencias poli-(C) s sin embargo, no resultan solamente en un incremento de la inclusión exónica: esta observación implica que quizás otros factores con carácter estimulador podrían unirse a las Cs y modular el procesamiento alternativo a través de estas secuencias.
