Diseño, síntesis y fotofísica de nuevos sensores fluorescentes aplicables a la detección de eventos biológicos en células vivas y tejidos
- Autores: Javier Valverde Pozo
- Directores de la Tesis: Eva María Talavera Rodríguez (codir. tes.), José Manuel Paredes Martínez (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2023
- Idioma: español
- ISBN: 9788411178679
- Número de páginas: 281
- Tribunal Calificador de la Tesis: Ángel Orte Gutiérrez (presid.), María Eugenia García Rubiño (secret.), Rafael Contreras Montoya (voc.), María Ángeles Serrano García (voc.), María Paz Fernández-Liencres de la Torre (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Farmacia por la Universidad de Granada
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
- español
Multitud de enfermedades de diversa etiología son producidas por anomalías en el metabolismo del sistema enzimático. Por lo tanto, la detección de la actividad de ciertas enzimas proporciona información útil para el diagnóstico, el pronóstico, o la evaluación de la respuesta a la terapia. Entre las diferentes enzimas utilizadas como marcadores, existen tres que ocupan unas posiciones relevantes dadas sus implicaciones en la salud: la alanina aminopeptidasa (pepN), la dipeptidilpeptidasa IV (DPP IV) y la tirosinasa (TYR). Así, la pepN es una proteasa implicada en varios procesos patológicos, entre los que se encuentra la supervivencia, el crecimiento y el desarrollo de microorganismos, en concreto las bacterias gramnegativas o Gram (-). Por su parte, la DPP IV es una glicoproteína transmembrana encontrada en la circulación sanguínea, la cual juega un papel clave en procesos como el metabolismo de la glucosa y la estimulación de las células T. Adicionalmente, se encuentra sobreexpresada en cáncer de colon, riñón, próstata y tiroides, y puede servir incluso como marcador de diagnóstico en pacientes con enfermedades de depósito lisosomal. Finalmente, la TYR es una enzima cuya expresión o activación anómala está asociada con enfermedades como el melanoma o el Parkinson. Por todo ello, la detección de las mismas suscita un gran interés en la comunidad científica dado que, además de permitir el diagnóstico y seguimiento de la enfermedad en la que estén implicadas, pueden convertirse en dianas muy atractivas para la terapia farmacológica. Entre los distintos ensayos de actividad enzimática, las técnicas fluorimétricas, y más concretamente, la microscopía de imagen de fluorescencia, son de gran interés dada su alta sensibilidad y su carácter no invasivo. Adicionalmente, la microscopía de fluorescencia con excitación por dos fotones (Two-photon microscopy, TPM) de longitud de onda cercana al infrarrojo (por sus siglas en inglés, NIR) permite lograr imágenes a mayor profundidad del interior del organismo estudiado, mientras que la microscopía de fluorescencia de superresolución (entre las distintas existentes, el método STED, Stimulated Emission Depletion) consigue, como su nombre indica, la adquisición de imágenes con una mejoría asociada en su resolución. Por ello, la síntesis y aplicación de nuevas sondas fluorescentes NIR, excitables por dos fotones y útiles para microscopía de superresolución adquiere un gran interés en el análisis biológico. Como consecuencia de la anterior introducción, se ha planteado la presente Tesis Doctoral con los objetivos de sintetizar, caracterizar fotofísicamente y aplicar al estudio de células, tejidos y organismos vivos, tres nuevos sensores fluorescentes que sean específicos para cada una de las tres enzimas citadas y que cumplan los requisitos mencionados con anterioridad. Para ello, partiendo del derivado del dicianometileno-4H-pirano (DCM-NH2), bien conocido como sensor NIR en el que existe una transferencia de carga intramolecular (por sus siglas en inglés, ICT), se han obtenido los sensores DCM-NH-Ala, DCM-NH-Pro-Gly y DCM-HBU, mediante el acoplamiento de un residuo alanina, un dipéptido de prolina-glicina, y un grupo 4-hidroxibencilamina, respectivamente, como grupos sensibles a la actuación de pepN, DPP IV y TYR. La adición de los grupos mencionados extingue (quenchea) la fluorescencia NIR del fluoróforo DCM-NH2 debido al fuerte efecto como aceptor electrónico del enlace amida. Posteriormente cuando actúe la enzima en cuestión, se libera el DCM-NH2 restaurándose la transferencia de carga intramolecular y emitiendo una intensa señal fluorescente con máximo sobre los 660 nm. Debido a que las señales fluorescentes de los sensores se presentan en el intervalo entre 500 y 550 nm, que es el intervalo de longitudes de onda donde muestra una débil señal el compuesto DCM-NH- unido a los distintos aceptores electrónicos, los sensores sintetizados se pueden considerar como sondas ratiométricas, lo que supone una ventaja adicional en la detección, ya que permite el cálculo de la actividad enzimática a través de la relación entre la señal alrededor de 660 nm (correspondiente al DCM-NH2 que se genera cuando la enzima rompe el enlace amida) y la señal en el intervalo 500-550 nm. Con la síntesis y aplicación del sensor DCM-NH-Ala se ha propuesto una nueva metodología para la identificación de bacterias gramnegativas que expresan pepN. Así, la hidrólisis de este sustrato por pepN produce un fuerte aumento de la banda de fluorescencia con pico a 662 nm cuando es excitada por un único fotón de 480 nm o por dos fotones NIR (de aproximadamente 800 nm). La velocidad de aumento de la señal de emisión depende de las concentraciones intracelulares de pepN, lo que proporciona una potente herramienta para detectar diversas bacterias virulentas en pocos minutos y con las ventajas inherentes a la excitación bifotónica. Se ha resuelto la cinética enzimática, obteniéndose los parámetros de Michaelis-Menten y se ha estudiado la fotofísica del fluoróforo DCM-NH2 liberado. Además, el DCMNH2 cumple los requisitos para su uso en microscopía de superresolución. Con esta metodología se ha conseguido mostrar que en bacterias con alta actividad pepN, los sitios de producción de la enzima se encuentran situados principalmente en la membrana bacteriana, así como en algunas estructuras del interior del cuerpo bacteriano. Adicionalmente, se ha demostrado la utilidad de este sensor en la medida de la actividad enzimática durante la formación de biofilms bacterianos. En lo que respecta al sensor DCM-NH-Pro-Gly, cuando el grupo dipéptido es liberado por la acción enzimática específica de la DPP IV, de nuevo el ICT del DCM-NH2 se restablece, formando un sistema que muestra una elevada fluorescencia ratiométrica. Con esta nueva sonda, se ha podido detectar, rápida y eficazmente, la actividad enzimática de la DPP IV en células vivas y tejidos humanos cancerígenos, tanto de colon como de riñón, así como en organismos enteros, utilizando el pez cebra, en el que se ha seguido la expresión cuantitativa de la actividad de DPP IV con los días post fecundación (dpf) de los peces, mediante el cálculo cuantitativo de la intensidad de fluorescencia NIR. En adición a estos resultados y debido a la posibilidad de la excitación multifotónica, se ha podido detectar cuantitativamente, la actividad de DPP IV en el suero humano de una forma directa, sin la necesidad de tratamientos adicionales que eliminen la autofluorescencia (y el posterior e incontrolable fotoblanqueo) que muestra el suero humano cuando se excita por un solo fotón de luz visible. Por último, el sustrato DCM-HBU libera la ya mencionada señal fluorescente NIR tras una oxidación mediada por TYR seguida de la hidrólisis del enlace ureico. Como se ha indicado en los casos anteriores, el colorante liberado muestra la característica fluorescencia ratiométrica. En este caso, la posibilidad de la excitación multifotónica permite la obtención de imágenes de fluorescencia en tejidos de melanoma (en los que TYR está sobreexpresada) a mayores profundidades tisulares que las sondas hasta ahora propuestas, debido a que tanto la luz de excitación como la de emisión tienen una longitud de onda que evita los inconvenientes que acarrea la luz UV y Visible en los sistemas biológicos, como son la absorción celular, la autofluorescencia y la dispersión. Además, la sonda también es útil para la detección cuantitativa de la actividad TYR en organismos completos, como se ha demostrado en larvas de pez cebra con actividad TYR. Se espera que esta nueva sonda fluorescente NIR, bifotónica y ratiométrica sea útil para la detección precisa de TYR en biosistemas complejos a mayor profundidad que otras sondas fluorescentes anteriormente propuestas. Se debe resaltar que los estudios de inhibición para las tres enzimas, tanto in vitro como in vivo, revelan claramente que los sensores son sensibles a la actuación de su enzima correspondiente. Así, cuando esta es inhibida, el sustrato no sufre alteraciones significativas en sus propiedades fotofísicas.
- English
Abnormality of the enzyme metabolism system leads to a multitude of diseases of diverse aetiology. Therefore, the detection of the activity of certain enzymes provides valuable information useful for diagnosis, prognosis, or assessment of response to therapy. Among the different enzymes used as markers, there are three that occupy relevant positions given their implications in health: alanine aminopeptidase (pepN), dipeptidylpeptidase IV (DPP IV) and tyrosinase (TYR). Thus, pepN is a protease involved in several pathological processes, including the survival, growth and development of microorganisms, in particular Gram-negative or Gram (-) bacteria. DPP IV is a transmembrane glycoprotein found in the blood circulation, which plays a key role in processes such as glucose metabolism and T-cell stimulation. Additionally, it is overexpressed in colon, kidney, prostate and thyroid cancers, and may even serve as a diagnostic marker in patients with lysosomal storage diseases. Finally, TYR is an enzyme whose abnormal expression or activation is associated with diseases such as melanoma or Parkinson's disease. For all these reasons, the detection of these enzymes is of great interest to the scientific community since, in addition to allowing the diagnosis and monitoring of the disease in which they are involved, they can become very attractive targets for pharmacological therapy. Among the different enzyme activity assays, fluorimetric techniques, and more specifically, fluorescence imaging microscopy, are of great interest due to their high sensitivity and non-invasive nature. In addition, two-photon excitation fluorescence microscopy (TPM) at nearinfrared wavelengths (NIR) allows for in-depth imaging of the interior of the organism under study, while super-resolution fluorescence microscopy (among the various existing methods, the STED method, Stimulated Emission Depletion) achieves, as its name suggests, the acquisition of images with an associated improvement in resolution. Therefore, the synthesis and application of new NIR fluorescent probes, excitable by two photons and useful for super-resolution microscopy, is of great interest in biological analysis. As a consequence of the above introduction, this Doctoral Thesis has been proposed with the aims of synthesising, photophysically characterising and applying to the study of cells, tissues and living organisms, three new fluorescent sensors that are specific for each of the three enzymes mentioned above and that meet the aforecited requirements. For this purpose, by starting from the dicyanomethylene-4H-pyran (DCM-NH2) derivative, well known as a NIR sensor in which there is an intramolecular charge transfer (ICT), the DCM-NH-Ala, DCM-NH-Pro-Gly and DCM-HBU sensors have been obtained by coupling an alanine residue, a proline-glycine dipeptide, and a 4-hydroxybenzylamine group, respectively, as pepN, DPP IV and TYR-acting groups. The addition of the aforementioned groups quenches the NIR fluorescence of the DCM-NH2 fluorophore due to the strong electron acceptor effect of the amide bond. Subsequently, when the enzyme in question acts, DCM-NH2 is released, restoring the intramolecular charge transfer and emitting an intense fluorescent signal with a maximum above 660 nm. Since the fluorescent signals of the sensors occur in the range between 500 and 550 nm, which is the wavelength range where the DCM-NH- compound bound to the various electronic acceptors shows a weak signal, the synthesised sensors can be considered as ratiometric probes, which supposes an additional advantage in detection, as it allows the calculation of enzyme activity through the ratio between the signal around 660 nm (corresponding to the DCM-NH2 generated when the enzyme breaks the amide bond) and the signal in the range 500-550 nm. With the synthesis and application of the DCM-NH-Ala sensor, a new methodology for the identification of Gram-negative bacteria expressing pepN has been proposed. Thus, hydrolysis of this substrate by pepN produces a strong increase in the fluorescence band with peak at 662 nm when excited by a single photon of 480 nm or by two NIR photons (of approximately 800 nm). The rate of increase of the emission signal depends on the intracellular concentrations of pepN, providing a powerful tool to detect various virulent bacteria within a few minutes and with the inherent advantages of biphoton excitation. The enzyme kinetics has been solved, Michaelis-Menten parameters have been obtained and the photophysics of the released DCM-NH2 fluorophore has been studied. Furthermore, DCMNH2 meets the requirements for use in super-resolution microscopy. This methodology has shown that in bacteria with high pepN activity, the enzyme production sites are mainly located in the bacterial membrane, as well as in some structures inside the bacterial body. In addition, this sensor has been shown to be useful in the measurement of enzyme activity during bacterial biofilm formation. With regard to the DCM-NH-Pro-Gly sensor, when the dipeptide group is released by the specific enzymatic action of DPP IV, again the ICT of DCMNH2 is restored, forming a system that shows a high ratiometric fluorescence. With this new probe, it has been possible to detect, rapidly and efficiently, the enzymatic activity of DPP IV in live cells and human cancerous tissues, both colon and kidney, as well as in whole organisms, using zebrafish, in which the quantitative expression of DPP IV activity has been followed with the days post-fertilisation (dpf) of the fish, by quantitative calculation of the NIR fluorescence intensity. In addition to these results and due to the possibility of multiphoton excitation, it has been possible to quantitatively detect DPP IV activity in human serum in a direct way, without the need for additional treatments to eliminate the autofluorescence (and subsequent uncontrollable photobleaching) that human serum shows when excited by a single photon of visible light. Finally, the DCM-HBU substrate releases the aforementioned NIR fluorescent signal after TYR-mediated oxidation followed by hydrolysis of the ureic bond. As indicated in the previous cases, the released dye shows the characteristic ratiometric fluorescence. In this case, the possibility of multiphoton excitation allows fluorescence imaging in melanoma tissues (in which TYR is overexpressed) at greater tissue depths than previously proposed probes, because both excitation and emission light have a wavelength that avoids the drawbacks of UV and Visible light in biological systems, such as cellular absorption, autofluorescence and scattering. In addition, the probe is also useful for quantitative detection of TYR activity in whole organisms, as demonstrated in zebrafish larvae with TYR activity. It is expected that this new NIR, biphotonic, ratiometric fluorescent probe will be useful for the accurate detection of TYR in complex biosystems at greater depths than other previously proposed fluorescent probes. It should be noted that inhibition studies for all three enzymes, both in vitro and in vivo, clearly reveal that the sensors are sensitive to the action of their corresponding enzyme. Thus, when the enzyme is inhibited, the substrate does not suffer significant alterations in its photophysical properties
- español
