Resumen de Validación de métodos analíticos por cromatografía líquida alta resolución (HPLC) para la cuantificación de cefuroxima, delafloxacino y tilvalosina en muestras biológicas
- español
El uso de antibióticos tanto en medicina humana como en medicina veterinaria se está restringiendo en la actualidad debido a la elevada resistencia que ofrecen los microorganismos. Los estudios farmacocinéticos constituyen una herramienta muy valiosa a la hora de evaluar la concentración de fármaco en el organismo y establecer posologías adecuadas que aseguren el éxito clínico y minimicen el riesgo de aparición de resistencias bacterianas. Para poder realizar dichos estudios en muestras biológicas, tanto de humanos como de animales, es necesario previamente desarrollar y validar un método analítico para cuantificar las concentraciones del fármaco en la muestra de forma adecuada. En general, los métodos analíticos más usados en los estudios farmacocinéticos para la cuantificación del fármaco son los métodos cromatográficos. En este caso, el objetivo general de la presente tesis doctoral fue la validación de tres métodos analíticos para la cuantificación de tres antibióticos (cefuroxima, delafloxacino, tilvalosina) que permita la obtención de la concentración exacta del fármaco en diferentes matrices biológicas y de este modo utilizarlos para realizar los estudios farmacocinéticos pertinentes. El desarrollo, optimización y validación de un método analítico para la cuantificación de la cefuroxima se realizó en plasma humano mediante HPLC/UV. La extracción se realizó mediante precipitación de proteínas con metanol/TFA (ácido trifluoroacético). Los resultados obtenidos en los parámetros de validación fueron satisfactorios obteniendo una elevada recuperación (93.52 %,), alta selectividad y especificidad, con un valor en el error de la exactitud por debajo del 10 %. De igual forma, para el cálculo de la precisión se obtuvo un valor ˂ 10 % en el coeficiente de variación. Los límites de detección y cuantificación se establecieron en 0.1 y 0.25 µg/mL, respectivamente. Por lo que el método analítico propuesto es adecuado para ser aplicado en estudios clínicos, análisis de rutina y estudios farmacocinéticos. El desarrollo, optimización y validación de un método analítico para la cuantificación de delafloxacino se realizó en plasma humano mediante HPLC/FL. El proceso de extracción consistió en una extracción líquido-líquido con ácido fórmico al 50% y acetato de etilo. También se evaluó la estabilidad de dicho antibiótico en diferentes matrices y a diferentes temperaturas. Los resultados obtenidos en los parámetros de validación fueron satisfactorios obteniendo una elevada recuperación (98.3 %), alta selectividad y especificidad, un límite de detección de 0.05 µg/mL y un límite de cuantificación de 0.1 µg/mL. Los valores obtenidos en la precisión, expresados como coeficiente de variación, fueron ˂ 11%. De igual forma, los valores obtenidos para el error en la exactitud fueron ˂ 11%. Los resultados obtenidos en los estudios de estabilidad mostraron inestabilidad tanto en las muestras de plasma como en las disoluciones madre a partir de los quince días de almacenamiento a -40ºC. De ahí que se propongan nuevos estudios con el fin de asegurar la estabilidad del delafloxacino en diferentes condiciones de almacenamiento. El desarrollo, optimización y validación de un método analítico para la cuantificación de la tilvalosina se realizó en plasma de cerdo mediante HPLC/UV. La extracción se realizó mediante precipitación de proteínas con una solución al 0.1 % de ácido fórmico en acetonitrilo. También se evaluó la estabilidad de dicho antibiótico en diferentes matrices y a diferentes temperaturas. Los resultados obtenidos en los parámetros de validación fueron excelentes, obteniendo un rango en el valor de recuperación entre 89.66-96.92 %. Los límites de detección y cuantificación fueron de 0.05 μg/mL y 0.1 μg/mL, respectivamente. Con lo que respecta a los valores obtenidos para la precisión y el error en la exactitud, éstos fueron ˂ 13.0 % en ambos parámetros. Hay que destacar la buena selectividad y especificidad del método analítico. Finalmente, los resultados obtenidos en los estudios de estabilidad a -40ºC fueron también satisfactorios demostrando la estabilidad a corto y largo plazo. Por lo que se puede concluir que este método puede ser aplicado en estudios clínicos, monitorización de niveles eficaces y estudios farmacocinético.
- English
The use of antibiotics in both human and veterinary medicine is currently being restricted due to the high resistance offered by microorganisms. Pharmacokinetic studies are a very valuable tool to assess drug concentration in the body and to establish appropriate dosages in order to ensure clinical success and minimize the risk of the appearance of bacterial resistance. In order to carry out these studies on biological samples, both from humans and animals, it is necessary first to develop and validate an analytical method to adequately quantify drug concentrations in the sample. In general, the analytical methods most used in pharmacokinetic studies for drug quantification are chromatographic methods. In this case, the general objective of this doctoral thesis was the validation of three analytical methods for the quantification of three antibiotics (cefuroxime, delafloxacin, tylvalosin) that allows to obtain exact concentrations of the drug in different biological matrices and thus use them to perform relevant pharmacokinetic studies. The development, optimization and validation of an analytical method for the quantification of cefuroxime was carried out in human plasma by HPLC/UV. Extraction was performed by protein precipitation with methanol/TFA (trifluoroacetic acid). Validation parameters were satisfactory, obtaining a high recovery (93.52%), high selectivity and specificity, with an accuracy error value below 10%. Similarly, for the calculation of precision, a value ˂ 10% was obtained in the coefficient of variation. Detection and quantification limits were 0.1 and 0.25 µg/mL, respectively. Therefore, the proposed analytical method is suitable to be applied in clinical studies, routine analysis and pharmacokinetic studies. The development, optimization and validation of an analytical method for the quantification of delafloxacin was performed in human plasma by HPLC/FL. The extraction process consisted of a liquid-liquid extraction with 50% formic acid and ethyl acetate. The stability of the antibiotic in different matrices and at different temperatures was also evaluated. Validation parameters were satisfactory, obtaining a high recovery (98.3%), high selectivity and specificity, a detection limit of 0.05 µg/mL and a quantification limit of 0.1 µg/mL. The values obtained in precision, expressed as coefficient of variation, were ˂ 11%. Similarly, the values obtained for the accuracy error were ˂ 11%. Stability studies showed instability in both plasma samples and mother solutions after fifteen days of storage at -40ºC. Hence, new studies are needed to ensure the stability of delafloxacin in different storage conditions. The development, optimization and validation of an analytical method for the quantification of tylvalosin was carried out in pig plasma by HPLC/UV. Extraction was performed by protein precipitation with a 0.1% solution of formic acid in acetonitrile. Antibiotic stability in different matrices and at different temperatures was also evaluated. Validation parameters were excellent, obtaining a range in the recovery value between 89.66-96.92%. The detection and quantification limits were 0.05 μg/mL and 0.1 μg/mL, respectively. Regarding the values obtained for precision and accuracy error, these were both lower than 13.0%. The good selectivity and specificity of this analytical method should be highlighted. Finally, the results obtained in the stability studies at -40ºC were also satisfactory, demonstrating short- and long-term stability. Therefore, it can be concluded that this method can be applied in clinical studies, effective levels monitoring and pharmacokinetic studies.
