Estudio de la familia de proteínas quinasas C como nodos de control en la señalización celular

• Autores: Emilio Manuel Serrano López
• Directores de la Tesis: Senena Corbalán García (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Murcia ( España ) en 2023
• Idioma: español
• Número de páginas: 459
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: DIGITUM
• Resumen
  • español

    La Tesis Doctoral realizada ha profundizado en el conocimiento de la función de diferentes isoformas de la familia PKC, como son PKCα y PKCε, a través del estudio de su señalización en diferentes procesos celulares. Durante esta Tesis Doctoral, se ha estudiado y caracterizado la señalización mediada por PKCα en dos subtipos concretos de cáncer de mama: subtipo Luminal A, utilizando las células MCF-7 como modelo; y el subtipo basal o triple negativo, donde las células MDA-MB-231 fueron empleadas como modelo celular. Para comprender cómo la señalización por PKCα participaba en la regulación y desarrollo del proceso tumoral en las células MDA-MB-231, se ha desarrollado una línea celular que presenta inhibida la expresión de PKCα de manera estable a través del uso de la herramienta de edición genética CRISPR-Cas9. A través del estudio morfológico y funcional de esta línea celular modelo, y su comparación con la línea silvestre, ha sido posible identificar como la falta de PKCα y su señalización provoca alteraciones morfológicas en las células, afectando principalmente al citoesqueleto y a su organización tridimensional. Además, se identificó a PKCα como una quinasa importante en procesos tumorales como son la migración o invasión celular, viéndose seriamente afectados. Para profundizar en cómo PKCα provoca estas alteraciones en la morfología y funcionalidad de las células MDA-MB-231, se realizó un estudio proteómico comparado entre ambas líneas, donde se analizó el estado de activación del quinoma celular tras la inhibición de PKCα, así como el proteoma y fosfoproteoma. La integración de esta información permitió identificar a PKCα como un elemento importante para el correcto funcionamiento del ciclo celular, así como su papel en la regulación del citoesqueleto y procesos de motilidad celular a través de la regulación de la expresión y/o actividad de proteínas estructurales y componentes esenciales como las pequeñas GTPasas. Esta información fue utilizada para el desarrollo de una terapia combinada donde la inhibición de PKCα actúa como elemento central, identificando así el papel oncogénico de la isoforma en el cáncer de mama triple negativo. De manera análoga, se llevó a cabo el estudio de las rutas y vías de señalización donde PKCα aparece implicada en las células MCF-7, a través de su inhibición mediante pequeños ARN de interferencia. La información recogida de aquellas proteínas que experimentaban alteraciones en su expresión tras la inhibición de PKCα, sumada a la identificación del estado de activación de diferentes quinasas a través del array de quinasas, mostró a PKCα como una quinasa clave en la regulación de numerosas rutas necesarias para el desarrollo tumoral. Así, la ruta de señalización de las MAP quinasas, PI3K-AKT, señalización por interferón o p53, se vieron afectadas tras la inhibición de PKCα. Esta información, sumada a la alteración funcional que experimentan las células MCF-7, sitúan a PKCα como una quinasa oncogénica en este subtipo tumoral mamario. Para finalizar, se estudió cómo PKCε participa en los procesos de desgranulación celular en células RBL-2H3. El ácido fosfatídico se trata de un importante fosfolípido de membrana que aparece implicado en muchas funciones y eventos de señalización. Sin embargo, cómo su regulación afecta a la funcionalidad de PKCε en estas células no se conocía. Los resultados, obtenidos a través del uso de la microscopía TIRF, revelaron como esta señalización ejercería un papel de estabilización y preparación de las vesículas para los procesos de fusión vesicular a través de fenómenos de fosforilación sobre SNAP23, preparándolas así ante posibles estímulos de calcio que den lugar a la desgranulación de las células RBL-2H3. Estos resultados sitúan a PKCε como posible diana en reacciones alérgicas o desencadenadas por la activación de células mastoides.

  • English

    This PhD Thesis has deepened the knowledge of the function of different isoforms of the PKC family, such as PKCα and PKCε, through the study of their signaling in different cellular processes. During this PhD Thesis, PKCα-mediated signaling has been studied and characterized in two specific subtypes of breast cancer: Luminal A subtype, using MCF-7 cells as a model; and the basal or triple negative subtype, where MDA-MB-231 cells were used as a cellular model. To understand how PKCα signaling was involved in the regulation and development of the tumour process in MDA-MB-231 cells, a cell line that stably inhibited PKCα expression was developed by the gene editing tool CRISPR-Cas9. Through the morphological and functional study of this model cell line, and its comparison with the wild-type line, it has been possible to identify how the lack of PKCα and its signaling causes morphological alterations in the cells, mainly affecting the cytoskeleton and its three-dimensional organization. In addition, PKCα was identified as an important kinase in tumor processes such as cell migration or invasion, being seriously affected. To further investigate how PKCα causes these alterations in the morphology and functionality of MDA-MB-231 cells, a comparative proteomic study was performed between both cellular lines, where the activation state of the cellular kinome after PKCα inhibition was analyzed, as well as the proteome and phosphoproteome. The integration of this information allowed the identification of PKCα as an important element for the correct functioning of the cell cycle, as well as its role in the regulation of the cytoskeleton and cell motility processes through the regulation of the expression and/or activity of structural proteins and essential components such as small GTPases. This information was used for the development of a combination therapy, where PKCα inhibition acts as a central element, thus identifying the oncogenic role of the isoform in triple-negative breast cancer. Similarly, the study of the signaling pathways where PKCα appears involved in MCF-7 cells, through its inhibition by small interfering RNA, was carried out. The information collected from those proteins that experienced alterations in their expression after PKCα inhibition, added to the identification of the activation state of different kinases through the kinase array, showed PKCα as a key kinase in the regulation of numerous pathways necessary for tumor development. For example, the MAP kinase signaling pathway, PI3K-AKT, interferon signaling or p53, were affected after PKCα inhibition. This information, added to the functional alteration experienced by MCF-7 cells, places PKCα as an oncogenic kinase in this mammary tumor subtype. Finally, we studied how PKCε participates in cell degranulation processes in RBL-2H3 cells. Phosphatidic acid is an important membrane phospholipid involved in many functions and signaling events. However, how its regulation affects PKCε functionality in these cells was not known. The results obtained using TIRF microscopy revealed how this signaling would exert a role in stabilizing and preparing vesicles for vesicle fusion processes through phosphorylation phenomena on SNAP23, thus preparing them for possible calcium stimuli leading to degranulation of RBL-2H3 cells. These results place PKCε as a possible target in allergic reactions or reactions triggered by mast cell activation.