Caracterització i propietats de dues endo-?-(1,4)-glucanases implicades en l'estovament del fruit de maduixa.

• Autores: Francesc Xavier Palomer Tarridas
• Directores de la Tesis: Leonor Alegre Batlle (dir. tes.), Imma Llop Tous (dir. tes.), M. Vendrell Melich (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2002
• Idioma: catalán
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: TDX
• Resumen

  • Un dels enzims que podria tenir una acció important en lestovament de la maduixa és lendo-?-(1,4)-glucanasa (EGasa). Donat que aquest estovament produeix pèrdues comercials molt importants, es va plantejar lobjectiu de caracteritzar la funció biològica de dues endo-?-(1,4)-glucanases aïllades prèviament en fruit de maduixa: Cel1 i Cel2.

    En maduixa, lactivitat EGasa augmenta durant la maduració, i aquest augment coincideix temporalment amb lincrement dexpressió i acumulació proteica de Cel1 i Cel2. Lexpressió superposada de Cel1 i Cel2 en maduixa observada per Northern-blot, podria indicar una certa cooperació daquests dos enzims en el metabolisme dels polímers de la paret cellular que acompanya a la maduració del fruit. Cel1 en maduixera no sexpressa en teixits diferents del fruit, per tant, es pot afirmar que entre totes les EGases descrites fins ara, i que sexpressen en fruits, Cel1 és la que té el patró dexpressió més específic de maduració. Lacumulació de Cel2 durant el procés de maduració suggereix un paper important daquesta EGasa en lestovament dels fruits. A més, lexpressió de Cel2 en teixits en creixement dóna suport a una participació daquest gen en les modificacions de la paret cellular que acompanyen el creixement i lexpansió cellular.

    El punt isoelèctric trobat per Cel1 és de 85, molt proper al valor teòric predit a partir de la seqüència. Cel2 en canvi, presenta un punt isoelèctric de 50, molt diferent del valor teòric predit. Ambdues proteïnes presenten un senyal consens per la N-glicosilació, però només Cel1 té afinitat per la concanavalina A. Per tant, o bé només Cel1 està realment glicosilada in vivo, o més probablement, Cel1 i Cel2 es conjuguen amb residus glucosídics diferents.

    Leliminació dels aquenis del fruit inicia el procés de maduració de la maduixa, provocant un augment de lexpressió i de lacumulació proteica de Cel1 i Cel2. Donat que en els aquenis es produeix la síntesi i alliberació dauxines, es pot afirmar que Cel1 i Cel2 estan sota control negatiu de les auxines. Laplicació exògena detilè en fruits de maduixa no modifica lexpressió de Cel1 i Cel2, indicant que aquesta hormona no intervé en la regulació transcripcional daquests gens.

    Sha detectat cinc isoformes amb activitat endoglucanasa en extractes proteics totals de maduixa madura; una isoforma bàsica i quatre isoformes àcides. Mitjançant Western-blot del gel nadiu, sha vist que la isoforma de pI bàsic (pI 85) es correspon a Cel1, mentre una de les isoformes àcides, de pI 5-55, es correspon a la proteïna Cel2.

    La sobreexpressió de Cel1 en el llevat Pichia pastoris produeix una proteïna que es troba glicosilada i probablement unida iònicament a la paret cellular del llevat. Aquesta proteïna té un pH òptim dactivitat endoglucanasa de 75 i ha mostrat afinitat significativa només per substrats amb enllaços ?-(1,4): CMC, xiloglucans i Cellulosa CF-11. Per tant, els substrats potencials in vivo per la proteïna Cel1 podrien ser els xiloglucans i/o la cellulosa de la paret cellular.

    La inhibició antisentit de lexpressió de Cel1 en plantes transgèniques de maduixa disminueix clarament lacumulació de la proteïna i resulta en una reducció parcial de lactivitat endoglucanasa total en fruit madur. Estudis preliminars mostren que això es tradueix només en una lleugera disminució de la textura del fruit. Aquests resultats suggereixen que hi ha altres enzims implicats en lestovament del fruit que compensen la inhibició de Cel1, o bé que la contribució de Cel1 a lactivitat endoglucanasa total és petita.

    No shan pogut obtenir plantes de maduixa transgèniques antisentit amb expressió reduïda per Cel2. Aquest fet es podria explicar perquè Cel2 és un gen imprescindible per la planta, i per tant, sense la seva expressió les plantes no es poden desenvolupar.