Caracterización del fluido folicular y oviductal equino:: aplicación a las técnicas de fecundación in vitro
- Autores: Pablo Fernández Hernández
- Directores de la Tesis: Beatriz Macías García (dir. tes.), Lauro González Fernández (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Extremadura ( España ) en 2023
- Idioma: español
- Número de páginas: 139
- Tribunal Calificador de la Tesis: Manuel Álvarez Rodríguez (presid.), Jordana Luisa Portugal De Sena Lopes (secret.), Francisco Eduardo Martin Cano (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Salud Pública y Animal por la Universidad de Extremadura
- Materias:
- Enlaces
- Resumen
- español
El desarrollo de las técnicas de fecundación in vitro nos ha permitido producir embriones en el laboratorio en diferentes especies domésticas. Un paso importante en el avance de la producción de embriones in vitro ha sido el diseño de protocolos de maduración in vitro de ovocitos. El incremento del número de ovocitos madurados disponibles para ser fecundados in vitro ha propiciado que las técnicas de producción de embriones sean rentables y que sean usadas de forma rutinaria en numerosas especies domésticas incluida la equina.
Sin embargo, para conseguir resultados exitosos en el laboratorio es necesario conocer el ambiente en el que la maduración del ovocito y la fecundación suceden de manera fisiológica.
Los avances en el desarrollo de protocolos y medios de cultivo, tanto de maduración ovocitaria, como de fecundación in vitro conseguido en las especies domésticas, ha sido sin duda gracias a los estudios de la composición del fluido folicular y oviductal.
En el caballo, estos estudios son escasos, limitando la mejora de la eficiencia de las técnicas de reproducción in vitro. En base a lo anteriormente expuesto, en la presente Tesis Doctoral nos propusimos estudiar la composición del fluido folicular y oviductal. Los objetivos que nos planteamos fueron: 1 - Analizar la composición metabólica del fluido folicular preovulatorio equino y compararla con la de los medios comerciales usados para la maduración in vitro de ovocitos equinos. 2 - Analizar y comparar la composición proteica del fluido oviductal pre- y post-ovulatorio equino. 3- Estudiar el efecto de diferentes concentraciones de metabolitos encontrados en el fluido oviductal post-ovulatorio sobre parámetros relacionados con la capacitación en espermatozoides equinos descongelados, y 4- Comprobar el efecto del fluido oviductal post-ovulatorio en la inducción de la fosforilación en residuos de tirosina en espermatozoides descongelados y en la fecundación in vitro convencional.
En el primer trabajo de esta Tesis Doctoral demostramos diferencias en cuanto a la cantidad y tipos de metabolitos encontrados entre los dos principales medios comerciales de maduración in vitro usados: Tissue Culture Medium 199 y Dulbecco´s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F – 12 Ham y el fluido folicular equino. Veintidós metabolitos fueron identificados en el fluido folicular pre-ovulatorio, y se comprobó que nueve metabolitos no están presentes en los medios comerciales de maduración estudiados: acetilcarnitina, carnitina, citrato, creatina, creatina fosfato, fumarato, glucosa-1-fosfato, histamina y lactato.
En el segundo trabajo caracterizamos y comparamos la proteómica del fluido oviductal pre-ovulatorio y post-ovulatorio procedente de yeguas post mortem. Este análisis demostró que existen diferencias significativas en el proteoma periovulatorio, encontrándose 15 proteínas menos abundantes y 156 más abundantes en el fluido oviductal post-ovulatorio comparado con el pre-ovulatorio, perteneciendo el 54,3% de éstas últimas a la categoría de exosomas extracelulares.
En el tercer trabajo valoramos el efecto de diferentes concentraciones de metabolitos encontrados en el fluido oviductal: mioinositol (5–25 mM), lactato (6–60 mM), glicina (0,1–5 mM), β-alanina (1–6 mM) e histamina (0,05-0,4 mM), sobre parámetros relacionados con la capacitación en los espermatozoides equinos descongelados. Estos metabolitos fueron añadidos, a las concentraciones encontradas en el fluido oviductal post-ovulatorio, a un medio capacitante, y se evaluó su efecto sobre la motilidad, el potencial de membrana mitocondrial, la viabilidad, la reacción acrosómica, la producción de especies reactivas de oxígeno y la fosforilación en residuos de tirosina. Los resultados obtenidos demostraron que estos metabolitos, a las concentraciones usadas, no ejercen ningún efecto en los parámetros evaluados en los espermatozoides equinos descongelados.
Por último, demostramos que la adición de fluido oviductal a una concentración de 0,125% (v/v) a un medio capacitante induce fosforilación en residuos de tirosina en los espermatozoides equinos descongelados, pero no se asocia a una fecundación exitosa
- English
The development of in vitro fertilization techniques has allowed us to produce embryos in the laboratory in different domestic species. However, to achieve successful results it is necessary to know the environment in which these processes occur physiologically, for which it is essential to know the composition of the follicular and oviductal fluid. In the horse, these studies are uncommon, based on which in the present Doctoral Thesis we set out to study the metabolomic composition of preovulatory follicular fluid by comparing it with commercial media. Analyze and compare the proteomics of pre- and post-ovulatory oviductal fluid. To study the effect of different concentrations of oviductal metabolites on parameters related to capacitation in thawed equine spermatozoa. To test the effect of post-ovulatory oviductal fluid on the induction of tyrosine phosphorylation in thawed spermatozoa and in conventional in vitro fertilization. In the first work of this Doctoral Thesis, we found differences between the metabolites present in the preovulatory follicular fluid and in the commercial media. In the second work we demonstrated that there are significant differences in the periovulatory proteome. In the third work we evaluated the effect of different concentrations of metabolites found in the oviductal fluid: myoinositol, lactate, glycine, ß-alanine and histamine, demonstrating that these metabolites, at the concentrations used, do not exert effects on the parameters evaluated. Finally, we show that the addition of oviductal fluid at a concentration of 0.125% (v/v) to a capacitating medium induces tyrosine phosphorylation in spermatozoa, but is not associated with successful fertilization.
- español
