Resumen de Nuevos fármacos producidos por microorganismos del suelo y generación de un transportador dirigido por nanoanticuerpos
- español
Los productos naturales son la fuente más valiosa para el descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos y sustancias bioactivas. Específicamente los microorganismos de origen terrestre como hongos y actinobacterias constituyen actualmente la principal fuente de antibióticos, antifúngicos, anticancerígenos, inmunosupresores, anti-inflamatorios, insecticidas, herbicidas y antiparasitarios. Asimismo, estos productos han servido de andamio para el desarrollo de nuevos productos sintéticos. El suelo es un entorno complejo y dinámico que contiene una gran cantidad de biomasa metabólicamente activa de los tres reinos de la vida. La mayor parte de esta biomasa es microbiana, y la actividad de estos microorganismos juega un papel clave en diferentes procesos ecológicos y ambientales, incluidos los ciclos del carbono y del nitrógeno. El suelo es el componente ambiental con mayor biodiversidad, específicamente microbiana, a órdenes de magnitud del resto de componentes del ecosistema. Ello implica una enorme diversidad genética y metabólica que probablemente es un reflejo de la gran heterogeneidad edáfica a escalas que van desde kilómetros hasta micrómetros. Es a esta escala microscópica que los microorganismos interactúan con el suelo y otros organismos presentes en él, lo que juega un papel fundamental en el desarrollo de una compleja química de metabolitos secundarios, considerándose como una fuente rica en moléculas bioactivas únicas.
La enfermedad del sueño o tripanosomiasis africana es una enfermedad causada por el parasito protozoario T. brucei, que ocasiona un grave problema de salud en 36 países del África subsahariana y que además tiene un añadido impacto socioeconómico, debido a la infección tanto de humanos como del ganado doméstico. No existen vacunas disponibles frente a T. brucei debido a la capacidad que tiene el parásito para cambiar la glicoproteína variable de superficie (VSG, del inglés “variant surface glycoprotein”) evitando las respuestas mediadas por anticuerpos del huésped. El tratamiento principal se basa únicamente en quimioterapia, y aunque los fármacos utilizados son efectivos, la mayoría de ellos son viejos y están lejos del concepto moderno de fármaco en términos de toxicidad, especificidad y régimen terapéutico. Por lo tanto, existe una clara necesidad de nuevos tratamientos seguros y asequibles para su tratamiento. En este sentido, los productos naturales son la principal fuente de nuevos fármacos ya que son estructuras que han sido sintetizadas, degradadas y transformadas por sistemas enzimáticos. En la búsqueda de nuevas moléculas con actividad tripanocida, hemos realizado un cribado de alto rendimiento a partir de extractos microbianos de una librería de productos naturales procedentes de hongos y actinomicetos. El fraccionamiento de uno de estos extractos, perteneciente a un cultivo del hongo Amesia sp., generó un nuevo miembro de la familia de los curvicollides que ha sido designado como curvicollide D. El nuevo compuesto mostró una concentración inhibitoria 50 (IC50) 16 veces menor en Tripanosoma brucei que en células humanas. Además, indujo la detención del ciclo celular y la alteración de la estructura nucleolar. Finalmente, demostramos que el curvicollide D se une al ADN e inhibe la transcripción en los tripanosomas africanos, lo que provoca la muerte celular. Estos resultados constituyen el primer reporte sobre la actividad y modo de acción de un miembro de la familia de los curvicollides.
El otro compuesto seleccionado del cribado inicial, a partir de especies del género Amesia fué la chaetocina. La chaetocina mostró un efecto dependiente de la dosis sobre la viabilidad de T. brucei con una IC50 de 8,3 nM y con un índice de selectividad en células de mamíferos desde 15 a más de 120. La chaetocina entra al interior celular mediante endocitosis, lo que explicaría la alta sensibilidad en T. brucei, provocando un fallo en la citocinesis y finalmente muerte celular. Además, la chaetocina indujo alteraciones tempranas en la estructura del nucléolo y, específicamente, produjo la inhibición de la transcripción mediada por la ARN polimerasa I en el locus ribosómico y el sitio de expresión activo. Además, determinamos que la chaetocina estabilizaba estructuras G-quadruplex (G4), e inducia daños en el ADN en T. brucei. En conjunto, estos resultados demuestran que Chaetocina es un inhibidor específico de la transcripción mediada por la ARN Pol I en T. brucei a través de la unión a estructuras G4 induciendo daño en el ADN.
Finalmente, hemos producido un nanotransportador de fármacos para el tratamiento de la tripanosomiasis Africana humana (HAT, del inglés “Human African Tripanosomiasis”). Este nanosistema esta guiado por un nanoanticuerpo (Nb) que reconoce a la proteína invariable de superficie ISG75. Esta proteína está altamente conservada en los tripanosomas africanos, lo que convierte a este nanosistema en una potencial heramienta para el tratamiento de todos los tipos de HAT. Además, se ha añadido a este Nb la recuencia del péptido ligando del receptor de transferrina con objeto de facilitar al nanosistema el cruce de la barrera hematoencefálica. Experimentos in vitro e in vivo mostraron una alta especificidad de este nanosistema frente a T. brucei y curando la enfermedad en un modelo ratón de tripanosomiasis africana.
En esta tesis doctoral, ponemos de manifiesto la importancia de los extractos naturales, principalmente procedentes de hongos y actinomicetos del suelo como fuente de nuevos fármacos, y la importancia de dichos fármacos en el tratamiento de enfermedades como la tripanosomiasis Africana. Se aportan nuevas moléculas con capacidad tripanocida, con mecanismos de acción aún por explotar, así como una nueva perspectiva en el abordaje del tratamiento de enfermedades que afectan al sistema nervioso central (SNC), mediante la generación de un transportador de fármacos selectivo frente a T. brucei con potencial de atravesar la barrera hemato-encefálica (BHE).
- English
Natural products are the most valuable source for the discovery and development of new drugs and bioactive substances. Specifically, microorganisms of terrestrial origin, such as fungi and actinobacteria, are currently the main source of antibiotics, antifungals, anticancer, immunosuppressants, anti-inflammatories, insecticides, herbicides and antiparasitic drugs. Likewise, these products have served as a scaffold for the development of new synthetic products. Soil is a complex and dynamic environment that contains a large amount of metabolically active biomass from all three kingdoms of Life. Most of this biomass is microbial, and the activity of these microorganisms plays a key role in different ecological and environmental processes, including the carbon and nitrogen cycles. The soil is the environmental component with the greatest biodiversity, specifically microbial diversity, at orders of magnitude of the rest of the components of the ecosystem. This implies an enormous genetic and metabolic diversity that is probably a reflection of the great edaphic heterogeneity at scales ranging from kilometers to micrometers. It is at this microscopic scale that microorganisms interact with the soil and other organisms present in it, which plays a fundamental role in the development of a complex chemistry of secondary metabolites, being considered as a rich source of unique bioactive molecules.
African trypanosomiasis, caused by the protozoan parasite T. brucei, is a serious health with an added socio-economic impact in sub-Saharan Africa due to direct infection in both humans and their domestic livestock.
There is no vaccine available against African trypanosomes because of the ability of the parasite to change the variant surface glycoprotein (VSG) avoiding antibody-mediated responses. The main treatment relies only on chemotherapy and although the current treatments are effective, most of them are very old and far from the modern concept of a drug in terms of toxicity, specificity and therapeutic regime. Therefore, there is a clear need of novel, safe, and affordable treatments. In this regard, natural products are the main source of new drugs as they are structures that have been synthesized, degraded and transformed by enzymatic systems. In a search for new molecules with trypanocidal activity, we have performed a high throughput screening of microbial extracts from a fungi and actinobacteria natural products collection. Fractionation of one of these extracts, belonging to a culture of the fungus Amesia sp., yielded a new member of the curvicollide family that has been designated as curvicollide D. The new compound showed an inhibitory concentration 50 (IC50) 16-fold lower in Trypanosoma brucei than in human cells. Moreover, it induced cell cycle arrest and disruption of the nucleolar structure. Finally, we showed that curvicollide D binds to DNA and inhibits transcription in African trypanosomes, resulting in cell death. These results constitute the first report on the activity and mode of action of a member of the curvicollide family.
The other compound selected from the initial screening from Amesia sp. was Chaetocin. Chaetocin showed a dose dependent effect on trypanosome viability with an IC50 of 8.3 nM and with a selectivity index in mammalian cells from 15 to more than 120. Chaetocin is taken up by endocytosis, which would explain its high specificity for T. brucei.
Chaetocin caused a failure of cytokinesis and ultimately cell death. In additiro, chaetocin produced early disruption of the nucleolus structure and specifically ARN polimerase I transcription inhibition at the ribosomal locus and in the active expression site locus. Moreover, we found that chaetocin was able to stabilize G-cuadruplex structures (G4) present in the expression site and ribosomal locus. Taken together, these results demonstrate that chaetocin is a specific inhibitor of RNA Pol I-mediated transcription in T. brucei through binding to G4 structures.
Finally, we have produced a drug nanocarrier for the treatment of HAT. This nanosystem is guided by a nanobody that recognizes the invariant surface protein ISG75. This protein is highly conserved in African trypanosomes, which makes this nanosystem a potential tool for the treatment of all types of HAT. In addition, the sequence of the transferrin receptor ligand peptide has been added to this Nb in order to facilitate the nanosystem to cross the blood-brain barrier. In vitro and in vivo experiments showed a high specificity of this nanosystem against T. brucei and curing the disease in a murine model of African trypanosomiasis.
In this PhD thesis, we highlight the importance of natural extracts, mainly from soil fungi and actinobacteria, as powerful source of new drugs, and the importance of these drugs in the treatment of diseases such as African trypanosomiasis. New molecules with trypanocidal activity are provided, with mechanisms of action yet to be exploited, as well as a new perspective in the approach to the treatment of diseases that affect the central nervous system, through the generation of a selective drug transporter against T. brucei with the potential to cross the blood-brain barrier.
