Resumen de Efecto de la hipoxia sobre la eficacia terapéutica de células mesenquimales derivadas de tejido adiposo sobre la regeneración renal en un modelo experimental de nefropatía diabética.: Estudios in vitro e in vivo
1. Introducción o motivación de la tesis:
La Nefropatía Diabética (ND) es una de las complicaciones más severas de la diabetes mellitus (DM) [1] y se caracteriza, entre otras cosas, por la pérdida progresiva de la función renal. Además, es la principal causa de insuficiencia renal crónica en el mundo [2]. Lamentablemente, a día de hoy, las estrategias disponibles para su tratamiento solo son capaces de retrasar su evolución, haciendo inevitable para el paciente el requerimiento de terapias de sustitución renal [3], lo que supone un cuantioso gasto para el sistema nacional de salud o para el propio paciente.
La terapia celular basada en células troncales mesenquimales (MSCs) ha emergido como una alternativa en el tratamiento de la ND [4, 5].
Desafortunadamente, la DM está estrechamente relacionada con el deterioro de la funcionalidad de las MSCs [6]. Por lo tanto, se hace imperioso establecer técnicas que permitan restaurar y/o reducir dichas alteraciones.
Para su uso clínico, las MSCs deben de ser aisladas y expandidas ex vivo. Las condiciones de cultivo en el laboratorio comúnmente mantienen las células a una concentración de oxígeno igual a la atmosférica, del 20% al 21% (Normoxia, N), no obstante, in vivo, éstas residen en un microambiente hipóxico entre el 1% y el 5% de oxígeno (H) [7]. Varios estudios demostraron que el cultivo de MSCs en hipoxia mejora su actividad paracrina, migratoria, e inmunomoduladora [7, 8]. Por lo tanto, el preacondicionamiento de MSCs en hipoxia (PH) podría mejorar su efecto terapéutico. En este trabajo evaluamos el efecto del PH sobre la funcionalidad de MSCs derivadas de tejido adiposo procedentes de ratas sanas (ASCs-C) y diabéticas (ASCs-D), y su efectividad terapéutica en un modelo animal de ND inducido por estreptozotocina (STZ).
2.Contenido de la investigación:
El estudio fue llevado a cabo en dos fases.
Para la primera fase, in vitro, se aislaron ASCs de ratas Wistar isogénicas sanas (ASCs-C), y diabéticas (ASCs-D). En un inicio ambas poblaciones celulares fueron cultivadas en normoxia (N=21% de oxígeno), sin embargo, 48 horas previas al desarrollo de los ensayos in vitro parte de las células fueron PH (H=3% de oxígeno), originándose de esta forma cuatro tipos celulares: ASCs-CN, ASCs-CH, ASCs-DN y ASCs-DH.
La caracterización fenotípica y funcional se llevó a cabo mediante citometría de flujo y ensayos de diferenciación con medio específico, respectivamente; y los resultados mostraron que tanto las ASCs-C como las ASCs-D cultivadas en normoxia o hipoxia presentaron positividad en aproximadamente el 95% de la población para CD29, CD90 y CD73, y en menos del 2% de la población para CD34 y CD45. Además, fueron capaces de diferenciarse a adipocitos y osteoblastos.
Mediante el cultivo celular en un matrigel angiogénico se evaluó la capacidad para formar estructuras tubulares de cada uno de los tipos celulares. Los resultados mostraron que la exposición a la hipoxia incrementó significativamente la capacidad angiogénica tanto en las ASCs-C como en las ASCs-D. Se observó también una menor formación de estructuras tubulares en las ASCs-D, independientemente de las condiciones de cultivo, en comparación con las sanas.
La cuantificación de factores secretados a los sobrenadantes por las ASCs se realizó usando la técnica ELISA. En relación con la secreción de VEGF los resultados mostraron que las ASCs-D secretaron una menor cantidad de este factor en relación a las ASCs-C, diferencia que llegó a ser significativa cuando ambos tipos celulares fueron PH. Además, los resultados revelaron que los niveles de secreción de IL-6 fueron significativamente mayores en los sobrenadantes recolectados de las ASCs-D en comparación a las ASCs-C, tanto en las que fueron cultivadas en normoxia como las PH. Respecto a la secreción de EGF se encontró una tendencia a la reducción en su secreción por parte de las ASCs-D en comparación con ASCs-C en ambas condiciones de cultivo que llegó a ser significativa en el grupo de células cultivadas en normoxia.
La migración de las ASCs se realizó usando un sistema de insertos que junto a una placa de cultivo celular conformaban dos compartimientos separados por una membrana semipermeable que permitía la motilidad celular entre ambos espacios. Los resultados mostraron que las ASCs-D presentaron una capacidad de migración al SDF-1 significativamente menor en comparación con las ASCs-C tras el PH.
Con el propósito de identificar los cambios genómicos de cada uno de los grupos experimentales, se diseño un estudio de microarrays, para lo que se establecieron cuatro grupos comparativos: grupo 1. ASCs-CH vs. ASCs-CN, grupo 2. ASCs-DH vs. ASCs-DN, grupo 3. ASCs-DN vs. ASCs-CN y grupo 4. ASCs-DH vs. ASCs-CH. Una vez identificada la expresión diferencial de genes (DEGs) de cada grupo comparativo, se desarrolló un estudio bioinformático de enriquecimiento con el interfaz web DAVID y la herramienta clusterProfiler. Además, se construyeron redes de interacción proteica (PPI) con la herramienta STRING. El análisis bioinformático que comparó ASCs-CH vs. ASCs-CN mostró un enriquecimiento de términos relacionados con la membrana celular y una infrarrepresentación de términos vinculados con la mitosis, en condiciones de PH. Además, las PPIs entre el Abcc9-Kcnj8 y el Cenpk-Cenpn fueron las más representativas en la construcción de sus mapas de PPI con los DEGs sobre y subexpresados, respectivamente.
El estudio bioinformático que comparó ASCs-DH vs. ASCs-DN solamente arrojó un resultado significativo en la construcción de redes PPI con los DEGs sobreexpresados, donde la interacción entre Ntrk1-Adora2a fue la más representativa. Además, fue la comparación que mostró el menor número de DEGs (201).
Respecto al estudio que comparó ASCs-DN vs. ASCs-CN los resultados mostraron el enriquecimiento y la infrarrepresentación de términos relacionados con la glicosilación proteica y la regulación positiva de la expresión génica, respectivamente. En cuanto a la construcción de mapas de PPIs, las interacciones entre Blnk-Dapp1 y Hist1h3c-Hist2h4 fueron las más significativas de los DEGs sobre y subexpresados, respectivamente.
La comparación con herramientas bioinformáticas del ASCs-DH vs. ASCs-CH reveló el enriquecimiento y la infrarrepresentación de términos vinculados con la glicosilación proteica y la regulación positiva de la expresión génica, respectivamente. Además, el uso de la herramienta clusterProfiler mostró el enriquecimiento de las vías de interacción ligando-receptor neuroactivo, del ribosoma y del calcio, y la infrarrepresentación de la vía de infección por virus linfotrófico humano de células T tipo 1, de la desregulación transcripcional del cáncer y del factor de necrosis tumoral. Respecto a la construcción de mapas de PPIs, las interacciones entre Rpl11-Rps5 y Kdr-Vegfa fueron las más significativas para los DEGs sobre y subexpresados, respectivamente. Además, este grupo mostró el mayor número de DEGs respecto a las otras comparaciones (2213).
En la fase dos del estudio, se evaluó el efecto terapéutico de las cuatro poblaciones obtenidas en los estudios in vitro, en un modelo murino de ND inducido con STZ. Para ello 6 grupos de estudio fueron establecidos: grupo 1. Ratas sanas control que recibieron placebo (Solución salina) (C+P), grupo 2. Ratas ND que recibieron placebo (ND+P), grupo 3. Ratas ND tratadas con ASCs-CN (ND+ASCs-CN), grupo 4. Ratas ND tratadas con ASCs-CH (ND+ASCs-CH), grupo 5. Ratas ND tratadas con ASCs-DN (ND+ASCs-DN) y grupo 6. Ratas ND tratadas con ASCs-DH (ND+ASCs-DH).
Los resultados mostraron que en el día 0 del diseño in vivo, el peso y los parámetros bioquímicos de todos los animales se encontraban dentro de valores normales. También se evidenció que entre el día 15 y el día 45, las ratas pertenecientes a los grupos ND inducidos con STZ mostraron una reducción significativa y constante de la ganancia de peso, así como un incremento significativo y sostenido de sus valores de glucosa en sangre y albúmina en orina, que no se vieron afectados por ninguno de los tratamientos suministrados.
El día 45 se procedió al sacrificio de los animales y a la toma de muestras de tejido renal para desarrollar un estudio histológico y un análisis semicuantitativo del mismo. En general, este estudio mostró una reducción significativa de lesiones como expansión mesangial, mesangiolisis, necrosis tubular aguda, presencia de microaneurismas y depósitos tubulares, cambio a células claras, engrosamiento de la membrana basal tubular y glomerulomegalia en los grupos de ratas con ND que recibieron alguno de los tratamientos celulares, independientemente del tipo celular. Un análisis para detectar las diferencias entre tratamientos reveló que el grupo tratado con ASCs-CH produjo una mayor reducción de lesiones como el cambio a células claras y la glomerulomegalia. Este grupo celular produjo también una reducción significativa de la presencia de quistes tubulares, de fibrosis intersticial y de infiltrado inflamatorio respecto al grupo ND-placebo.
3.Conclusión:
El presente estudio demuestra que el PH no afecta el fenotipo ni a la funcionalidad de las ASCs in vitro, a excepción de su capacidad angiogénica. Además, el modelo experimental de ND ha demostrado que la administración intravenosa de ASCs-CH posee un efecto beneficioso sobre la recuperación del daño renal que supera al de los otros tipos celulares estudiados.
4. Bibliografía:
1. Li, H., et al., Paracrine effect of mesenchymal stem cell as a novel therapeutic strategy for diabetic nephropathy. Life Sciences, 2018. 215: p. 113-118.
2. Sharaf El Din, U.A.A., M.M. Salem, and D.O. Abdulazim, Diabetic nephropathy: Time to withhold development and progression - A review. J Adv Res, 2017. 8(4): p. 363-373.
3. Lim, A., Diabetic nephropathy - complications and treatment. Int J Nephrol Renovasc Dis, 2014. 7: p. 361-81.
4. Li, Y., et al., Early intervention with mesenchymal stem cells prevents nephropathy in diabetic rats by ameliorating the inflammatory microenvironment. Int J Mol Med, 2018. 41(5): p. 2629-2639.
5. Paulini, J., et al., Mesenchymal Stem Cells as Therapeutic Candidates for Halting the Progression of Diabetic Nephropathy. Stem cells international, 2016. 2016: p. 9521629-9521629.
6. Saki, N., et al., Adverse effect of high glucose concentration on stem cell therapy. Int J Hematol Oncol Stem Cell Res, 2013. 7(3): p. 34-40.
7. Choi, J.R., K.W. Yong, and W.K.Z. Wan Safwani, Effect of hypoxia on human adipose-derived mesenchymal stem cells and its potential clinical applications. Cell Mol Life Sci, 2017. 74(14): p. 2587-2600.
8. Maacha, S., et al., Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stromal Cells in Angiogenesis. Stem Cells Int, 2020. 2020: p. 4356359.
