Evaluación de la expresión diferencial de hotspots de roturas de doble hebra de ADN y su regulación por la respuesta daño genómico en la meiosis de Saccharomyces cerevisiae

• Autores: David Álvarez Melo
• Directores de la Tesis: Jesús Ángel Carballo González-Corroto (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Complutense de Madrid ( España ) en 2022
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Tomás Naranjo Pompa (presid.), Nieves Cuñado Rodríguez (secret.), Susana Rodríguez Navarro (voc.), Pedro Antonio San Segundo Nieto (voc.), Cristina Martín Castellanos (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología por la Universidad Complutense de Madrid
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología celular
      • Citogenética
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Docta Complutense
• Resumen
  • español

    La meiosis es un proceso celular común a los organismos con reproducción sexual. Durante la profase de la primera división meiótica se ocasiona daño genómico en forma de roturas de doble cadena de ADN para asegurar el apareamiento de los cromosomas homólogos y la correcta segregación de estos. Estas roturas ocurren en lugares concretos del ADN conocidos como puntos calientes o hotspots. Sin embargo, a día de hoy muchos de los procesos que regulan la producción de este daño no están completamente descritos.

    En la presente tesis se ha pretendido comprobar un modelo de predicción que cataloga a los hotspots del organismo Saccharomyces cerevisiae en dos poblaciones. Una de las poblaciones estaría más regulada por la fosforilación de la proteína Rec114, perteneciente al complejo Spo11, encargado de efectuar el daño en el ADN, y la otra respondería menos a esta regulación. De esta manera en los hotspots menos regulados se acumularían roturas más rápido que en los más regulados.

    Para probar la validez del modelo, en este estudio, se tomaron parejas hotspots, uno perteneciente a cada población, y se compararon entre ellos en cuanto a la diferencia temporal existente a la hora de alcanzar el cincuenta por ciento del máximo de roturas. Los resultados mostraron que todos los hotspots de la población menos regulada se expresaron más rápido que los de la más regulada. También se comprobó que existían diferencias estadísticas en lo referente a la temporalidad de producción de roturas en la mitad de las parejas de hotspots estudiadas. Por lo tanto, los resultados sugieren que el modelo podría ser válido. Sin embargo, se necesitan más estudios para ratificarlo.

    Por otro lado, en esta tesis se ha pretendido comprobar los efectos que la mutación de RAD53 tuviese para la producción de roturas de doble cadena. Sin embargo, los resultados mostraron que la ausencia de la actividad de este gen durante el ciclo de crecimiento vegetativo causa un aumento de células detenidas en la fase G2 del ciclo. Esto imposibilitó comprobar el efecto de la mutación de Rad53 sobre las roturas de doble cadena.

    Los resultados mostraron también que la mutación de RAD9, gen que codifica una proteína encargada de activar a Rad53 en respuesta a daño en el ADN, no causa esta clase de alteraciones en el ciclo. Es por tanto que delecionar RAD9 podrá ser utilizado como aproximación en futuros análisis para comprobar el efecto de Rad53 sobre los hotspots de roturas de doble cadena meióticas.

    Por último, se ha pretendido dilucidar la causa por la que la sustitución por alanina de la treonina 181 de Hop1, proteína perteneciente a los elementos axiales del complejo sinaptonémico, causa un descenso en la viabilidad de esporas y en la cantidad de roturas de doble cadena meióticas.

    Se ha comprobado, mediante la producción exógena de roturas de doble cadena, que la presencia de la treonina 181 de Hop1 es necesaria para que, a su vez, Hop1 sea fosforilada en respuesta a ese daño.

    También se ha observado que la sustitución de la treonina 181 por aminoácidos fosfomiméticos, esto es, que actúan como si estuviesen constitutivamente fosforilados, es capaz de restaurar parcialmente la viabilidad de esporas. En cuanto a este parámetro, se ha examinado que una mayor dosis génica es capaz de resturar la viabilidad de determinados mutantes de HOP1 codificantes para sustituciones de la treonina 181.

    Por último, cepas heterocigotas con un alelo de HOP1 codificante para una sustitución en la treonina 181 y un alelo de HOP1 codificante para una sustitución en la treonina 318, mostraron una reducción en la viabilidad de esporas.

    Todos estos resultados sugieren que es improbable que la treonina 181 de Hop1 sea fosforilada y que, a su vez, es necesaria para la estabilidad estructural de la proteína o bien para la correcta interacción de esta con otros componentes del complejo sinaptonémico. Futuros estudios deberán aproximarse a la estabilidad de Hop1 cuando la treonina 181 ha sido sustituida.

  • English

    During meiosis two cellular divisions are preceded by a single round of genome replication. In Saccharomyces cerevisiae, for meiosis to being correctly produced, homologous chromosomes must pair, synapse and recombine.Recombination has its origin in double strand breaks (DSBs) catalyzed by the Spo11 complex. They are spatiotemporally regulated by Mec1 and Tel1 kinases. These kinases phosphorylate residues known as (S/T)Q: serines and threonines followed by a glutamine in the aminoacidic sequence.It has been established that the phosphorylation by Tel1 of Rec114, one of the components of the Spo11 complex, leads to the inhibition of DSBs formation. When all the (S/T)Q residues of Rec114 are substituted by phosphomimetic aminoacids, a delay in the production of double strand breaks occur. This delay entails a reduction in the quantity of DSBs when it occurs in rad50S/sae2Δ genetics backgrounds. This reduction in DSBs is similar to the one seen when DSBs production is delayed by delaying DNA replication in rad50S/sae2Δ backgrounds. However, this reduction does not occur in wild type backgrounds or dmc1Δ, being the Dmc1 protein a meiotic recombinase.It has also been reported that the quantity of described hotspots in rad50S/sae2Δ backgrounds is lesser than the quantity of hotspots described in dmc1Δ backgrounds. One possible cause for this is that the hotspots that are not expressed in rad50S/sae2Δ strains may be highly regulated by Rec114. The rest of the hotspots, which are expressed under these conditions, would be less regulated by this protein...