Resumen de Insights into nitrogen monoxide (no) roles and biosynthesis in the lichen ramalina farinacea and its symbionts
Joana Remedios Expósito Piñero
ANTECEDENTES La biodiversidad se ve comprometida por perturbaciones naturales y antropogénicas como el cambio climático y la contaminación y es importante conocer las causas y encontrar soluciones para salvaguardarla. Las especies interactúan y su desaparición puede causar un gran impacto en otras y/o sobre el medio ambiente. Los líquenes, al igual que otros organismos simbióticos, pueden ser más sensibles a estas perturbaciones debido a las interacciones entre sus simbiontes y su naturaleza.
Los líquenes están compuestos al menos por un hongo heterótrofo (micobionte) y organismos fotosintéticos (fotobiontes) ya sean algas (ficobiontes) y/o cianobacterias (cianobiontes). El concepto tradicional debe ampliarse, ya que se han detectado numerosos agregados bacterianos y la presencia de levaduras que son necesarios para el funcionamiento y supervivencia del liquen. Estos organismos pueden encontrarse en la mayoría de los hábitats y pueden tolerar condiciones extremas y seguir realizando sus funciones vitales. La liquenización permite el desarrollo de sus simbiontes en esas difíciles condiciones, lo que no sería posible de forma aislada.
Estos organismos son poiquilohidros, carecen de ceras y cutículas, por lo que están sometidos a continuos ciclos de desecación/rehidratación lo cual genera una liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS) que, si supera la capacidad de las defensas antioxidantes, puede producir estrés oxidativo. Los líquenes absorben directamente los nutrientes de la atmósfera debido a la ausencia de órganos específicos de captación. En general, estos organismos muestran una gran tolerancia al estrés abiótico porque poseen mecanismos para amortiguar la liberación de ROS. Numerosas especies son tolerantes a metales pesados, como el Pb, porque además de tener un gran sistema antioxidante, presentan mecanismos para excluirlo o inmovilizarlo en el espacio extracelular, como se ha estudiado ya en el liquen Ramalina farinacea.
Por otro lado, el monóxido de nitrógeno (NO) es una molécula de señalización celular multifacética que se ha descrito como uno de los primeros mecanismos de defensa frente al estrés oxidativo en células eucariotas y es clave en las interacciones simbióticas. Esta molécula también desempeña un importante rol en la regulación de la apoptosis, un proceso biológico de eliminación de células dañadas que parece mejorar la eficacia biológica en condiciones estresantes, pero que no se ha estudiado en líquenes. La biosíntesis de NO se produce en plantas principalmente por la nitrato reductasa (NR) y por la NO sintasa (NOS) en animales, si bien existe una actividad similar a la NOS también en plantas cuyo origen aún no ha sido desentrañado. Sin embargo, se ha descrito la presencia de NOS en algunas microalgas y hongos, organismos participantes en la simbiosis liquénica.
Se sabe que esta molécula se libera en líquenes como R. farinacea durante condiciones estresantes como la rehidratación y se ha observado su capacidad de reducir el exceso de ROS provocado por estas condiciones. Por todo lo anterior, se ha querido profundizar más sobre los roles del NO en la tolerancia a metales pesados como el Pb, su implicación en la muerte celular activa y su biosíntesis utilizando como modelo al liquen R. farinacea.
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Nuestra hipótesis es que el NO tiene funciones importantes en los líquenes y en sus simbiontes siendo clave en la simbiosis y en la tolerancia al estrés abiótico. El objetivo general de la presente tesis es analizar la importancia del NO en la simbiosis liquénica y en la tolerancia al estrés oxidativo, así como la exploración de sus mecanismos de síntesis. Y se han planteado los siguientes objetivos:
✓ Conocer el papel del NO frente al estrés oxidativo generado durante la rehidratación y en presencia del metal pesado Pb en R. farinacea y sus ficobiontes.
✓ Estudiar la posible existencia de muerte celular activa y la implicación del NO en este proceso biológico en R. farinacea y sus ficobiontes.
✓ Identificar la contribución de la NR y la NOS a los mecanismos de síntesis de NO en R. farinacea y sus simbiontes.
METODOLOGÍA Para lograr los objetivos de la presente tesis se emplearon diversas metodologías y técnicas instrumentales, las cuales se resumen a continuación:
Material biológico y cultivos Los talos de R. farinacea fueron recogidos directamente en San Lorenzo de El Escorial. Estos fueron deshidratados durante 24h y fueron guardados a -80ºC hasta su análisis. Los ficobiontes aislados de R. farinacea (Trebouxia jamesii TR1 y T. lynnae TR9) fueron cultivados en condiciones de esterilidad en medio Bold 3N (19ºC, 14h luz/ 10h oscuridad). Tras 21 días se utilizaron frescos el mismo día o se conservaron a -80ºC hasta su análisis.
Tras conseguir el aislamiento del micobionte de manera estéril, este se sembró en medio semi-sólido con extracto de levadura, patata y dextrosa (conocido como “YPD”) con ampilicina en las mismas condiciones que los ficobiontes y se resembró cada 2-4 semanas.
Espectrofluometría Para medir la producción de radicales libres se utilizó la sonda DCFH2-DA que, en contacto con estos, da lugar a DCF, mesurable a ʎexc 485 nm y ʎem 535 nm. La autofluorescencia de la clorofila se midió a ʎexc 485 nm y ʎem 635 nm. El análisis para detectar muerte celular se realizó con las tinciones de ácidos nucleicos, YO-PRO-1 y Hoechst 33342, utilizándose los siguientes filtros: λexc 485, λem 528 nm y λexc 360, λem 460 nm, respectivamente. Por último, la actividad caspasa se cuantificó con el kit CellEvent® Caspasa-3/7, la cual emite fluorescencia verde a λexc 485 y λem 528 nm.
Espectrofotometría UV-visible Para la medida de la peroxidación lipídica se estimó el malondialdehido (MDA) con el test del ácido tiobarbitúrico (TBARS) y para la cuantificación de nitrito se empleó el método de Griess.
Cuantificación de nitrito El método de Griess consiste en hacer reaccionar al nitrito con sulfanilamida produciendo una sal de diazonio que al unirse con naftiletilendiamina forma un compuesto azoico de color rosado medible a 540 nm. Se empleó el SKALAR para la cuantificación de productos finales de oxidación del NO, primero se analizó la reducción de nitrato a nitrito con el método de reducción del cadmio empleando una columna cobre-cadmio y en la segunda fase se hizo reaccionar el nitrito producido con naftiletilendiamina formándose el compuesto azoico mencionado. Para obtener la actividad específica de la NR se cuantificó el nitrito producido en condiciones controladas con el método de Griess y para medir la actividad específica de la NOS se utilizó un kit comercial basado en la reacción de productos finales de NO empleando también este método.
Microscopía óptica y de fluorescencia Se realizaron análisis de la fluorescencia de las tinciones de ácidos nucleicos (YO-PRO-1 y Hoechst 33342) y de actividad caspasa mediante microscopía de fluorescencia. El tratamiento de las imágenes se realizó con el software LAS EZ. También, se empleó el microscopio óptico para visualizar la distribución morfológica de la peroxidación lipídica (TBARS) y de actividad NADPH-diaforasa.
RESULTADOS Capítulo 1 El NO amortigua los radicales libres producidos durante la rehidratación y modula la autofluorescencia de la clorofila durante la rehidratación y la presencia de Pb en el holobionte R. farinacea y sus ficobiontes aislados. La rehidratación con Pb genera un potente mecanismo antioxidante (efecto hormético) que no parece depender del NO en R. farinacea y en el ficobionte T. jamesii (TR1). Sin embargo, la participación del NO en dicho efecto hormético es compleja y parece influir en la respuesta e interacción de los simbiontes liquénicos, teniendo un papel crucial en el ficobionte T. lynnae (TR9). Además, los ficobiontes de R. farinacea presentan diferentes respuestas en cuanto al papel del NO en la modulación de la autofluorescencia de la clorofila.
Capítulo 2 La tinción de ácidos nucleicos con YO-PRO-1 o Hoechst 33342 utilizada en otros modelos biológicos no parecen ser buenos métodos para estudiar la muerte celular activa en R. farinacea y sus ficobiontes aislados. Por otra parte, este liquen y sus ficobiontes presentan actividad tipo caspasa, inducible por inductores químicos clásicos de apoptosis, esto parece confirmar la existencia de muerte celular activa en condiciones estresantes como la rehidratación. Por último, la actividad tipo caspasa disminuye al secuestrar el NO, sugiriendo que esta molécula podría estar implicada en la regulación positiva de la muerte activa en dicho liquen y sus ficobiontes.
Capítulo 3 R. farinacea presenta actividad específica NR cuantificada con un método para plantas ligeramente modificado. El tungstato, inhibidor de la NR, provocó la disminución de los niveles de NO y el aumento del MDA (peroxidación lipídica). Por otro lado, el L-NAME, inhibidor de la NOS, no disminuyó los niveles de NO excepto en los primeros minutos (hasta los 30 min) pero si incrementó los niveles de MDA. Sin embargo, la actividad NADPH-diaforasa detectada sugiere una posible presencia de una actividad tipo NOS.
Capítulo 4 El método de cuantificación de NR se optimizó para el líquen R. farinacea y se obtiene una actividad específica 40 veces superior respecto al método de cuantificación utilizado en el capítulo 3. La actividad específica NADH-NR de R. farinacea es superior a la actividad NADPH-NR y con la adición simultánea de ambos cofactores. En el micobionte, las actividades específicas de NADH-NR y NADPH-NR son mayores que si se añaden ambos cofactores simultáneamente, lo cual sugiere la presencia de otra isoforma suplementaria que emplea NADPH en el micobionte de R. farinacea. En cambio, las actividades específicas de la NR en los ficobiontes no presentan diferencias entre especies y los cofactores añadidos.
El tungstato inhibe la actividad específica NADH-NR de R. farinacea y su micobionte, pero sólo parcialmente la del ficobionte T. jamesii. Además, la inmunodetección con el anticuerpo de la NADH-NR revela la presencia de una enzima similar a la de Arabidopsis thaliana (EC 1.7.1.1) en R. farinacea y su micobionte. Las actividades específicas de NR se encuentran en un rango similar en R. farinacea y sus simbiontes y son superiores a las actividades tipo NOS sugiriendo que la principal enzima de producción de NO es la NR. Por otra parte, la actividad específica tipo NOS es superior en los ficobiontes de R. farinacea y se encuentra en un rango similar a la actividad específica NR. La inhibición con L-NAME disminuye sólo parcialmente la actividad específica tipo NOS de T. jamesii. Por último, la inmunodetección con el anticuerpo de la iNOS no revela la presencia de esta proteína en R. farinacea ni sus simbiontes.
CONCLUSIONES Capítulo 1 El NO amortiguó la liberación de radicales libres y moduló la autofluorescencia de la clorofila tras la rehidratación del liquen R. farinacea y sus ficobiontes aislados. Por lo tanto, dicha molécula es clave en algunos aspectos del metabolismo energético y la homeostasis redox en este liquen. La presencia de Pb generó una inesperada reducción de producción de radicales libres en R. farinacea y sus ficobiontes. Aunque la participación del NO en este efecto hormético fue compleja, esta molécula es clave para la tolerancia al Pb en el ficobionte T. lynnae (TR9). Dicho ficobionte parece tener siempre mayor capacidad antioxidante y diferentes estrategias que T. jamesii (TR1) para afrontar condiciones adversas.
Capítulo 2 Las tinciones de ácidos nucleicos con YO-PRO-1 y Hoechst 33342 que se utilizan para detectar células apoptóticas no se consideran adecuadas para detectar muerte celular activa en R. farinacea y sus ficobiontes. La actividad tipo caspasa y su visualización por microscopía de fluorescencia sugieren la existencia de muerte celular activa, similar a la apoptosis, como proceso biológico para enfrentar situaciones estresantes como la rehidratación en este liquen y, especialmente, en sus ficobiontes. Además, el NO parece estar involucrado en la regulación positiva de dicho proceso.
Capítulo 3 Los inhibidores comúnmente utilizados de las actividades de NR y NOS causaron cambios en la peroxidación de lípidos y en los productos finales de NO durante la rehidratación de los talos en R. farinacea. Lo cual sugiere que el NO es una molécula clave frente a la tolerancia al estrés oxidativo en este liquen. La síntesis y la regulación del NO son complejas y pueden implicar tanto las vías del NR como de la NOS. La actividad NR parece ser la principal encargada de su producción en R. farinacea, aunque también parece evidenciarse indirectamente la presencia de actividad tipo NOS, ya que se visualizó actividad NADPH-diaforasa positiva.
Capítulo 4 La optimización de un método específico mostró que la actividad NADH-NR específica de los talos de R. farinacea es un orden de magnitud mayor que la de A. thaliana y está en el rango de la clorofita Ulva intestinalis. Los estudios de inhibición de actividad NR y su inmunodetección demostraron que R. farinacea y su micobionte presentan una Moco-NR canónica similar a la de plantas. Además, los resultados apuntaron a la existencia de otra isoforma suplementaria en el micobionte de R. farinacea que usa NADPH. Por lo tanto, la actividad NR parece estar participada por varias isoformas diferentes, incluyendo las Moco-NR canónicas y las no canónicas en el holobionte R. farinacea.
Por otra parte, la actividad específica de la NOS de los ficobiontes de este liquen se encontró en un rango similar al de la NR y fue mayor que en R. farinacea y su micobionte. Los análisis de inhibición de actividad NOS y su inmunodetección no revelan la presencia de una iNOS canónica similar a la de animales, ni en el talo, ni en los simbiontes aislados. La actividad tipo NOS es relativamente importante en los simbiontes aislados, pero resulta fuertemente deprimida en el holobionte por razones que deben ser investigadas más a fondo.
