Estudio del sistema Wzm/Wzt en Brucella y evaluación del candidato vacunal Rev1∆wzm frente a la brucelosis ovina

• Autores: Sara Mena Bueno
• Directores de la Tesis: Mª Jesús Grilló Dolset (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Pública de Navarra ( España ) en 2023
• Idioma: español
• Número de páginas: 354
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Academica-e
• Resumen
  • español

    La brucelosis es una enfermedad zoonótica causada por bacterias del género Brucella que, además, conlleva grandes pérdidas económicas. La principal fuente de infección para el ser humano son los rumiantes, en los que la enfermedad cursa con aborto y otras alteraciones reproductivas. En la mayoría de las regiones afectadas, la vacunación de los animales es la única estrategia realista para controlar la infección. La cepa atenuada B. melitensis Rev1 es la única vacuna recomendada frente a la brucelosis ovina y caprina, pero posee ciertos inconvenientes, entre los que destacan la virulencia en ovejas gestantes, la interferencia serológica que generan, la posibilidad de infectar al ser humano y la resistencia a los tratamientos con estreptomicina, que instan la búsqueda de nuevas vacunas. El lipopolisacárido liso (S-LPS) de Brucella es un conocido factor de virulencia y también el antígeno inmunodominante en las pruebas de diagnóstico, por lo que sus distintas modificaciones representan una interesante aproximación en la búsqueda de una vacuna segura. Entre las rutas de biosíntesis del S-LPS, el sistema de dos componentes Wzm/Wzt es el responsable de transportar el O-PS sintetizado en la cara citoplasmática de la membrana interna hasta el espacio periplasmático, para su posterior ensamblaje al core-lípido A para formar el S-LPS. El bloqueo de esta ruta conlleva la creación de mutantes con LPS rugoso (R-LPS) capaces de acumular un O-PS dentro de las bacterias que puede ser decisivo para generar una respuesta inmune efectiva frente a la infección. Sin embargo, aún se desconocen las implicaciones biológicas de cada proteína del transportador. En particular, el bloqueo del O-PS podría acarrear modificaciones en la envuelta bacteriana, ya que su transporte requiere la participación del bactoprenol como molécula portadora, el cual también está involucrado en la biosíntesis de otras estructuras celulares. Con el objetivo de profundizar en el conocimiento de este sistema transportador de Brucella y su potencial aplicación en el desarrollo de vacunas, en el capítulo 1 de esta tesis se presenta la construcción y caracterización de mutantes Δwzm/Δwzt simples y doble derivados de Rev1. Además, con fines comparativos, se construyeron mutantes ∆wzm derivados de B. abortus 2308 y S19, y se utilizó un mutante 16M∆wzm derivado de la cepa virulenta B. melitensis 16M previamente desarrollado en el grupo de Sanidad Animal del Instituto de Agrobiotecnología (IdAB). Como resultado, los mutantes carentes de O-PS externo exhibieron cambios de expresión génica, propiedades antigénicas del O-PS interno y cambios fenotípicos asociados a modificaciones de la membrana externa y/o de la pared celular. Además, los mutantes Rev1 ∆wzm/∆wzt fueron muy susceptibles tanto a polimixinas como a los antibióticos utilizados para el tratamiento de la brucelosis humana, en particular, a la estreptomicina; y mostraron una gran atenuación en ratón. Entre ellos, Rev1∆wzm destacó por inducir un pico de esplenomegalia transitoria, ser altamente inmunogénico y generar una protección eficaz frente a la infección virulenta por B. melitensis y por B. ovis en el modelo murino. En el capítulo 2, antes de estudiar la seguridad de Rev1∆wzm en su hospedador natural, se determinó la capacidad de este candidato vacunal para crecer en los medios de cultivo selectivos Farrell (FM) y CITA (CM), actualmente recomendados para el aislamiento primario de Brucella. La fuerte susceptibilidad del mutante a las polimixinas y la sinergia observada entre colistina y vancomicina conllevaron una severa inhibición de este candidato vacunal en ambos medios selectivos. Para resolverlo, se reformuló y evaluó el denominado Brucella Selective Medium (BSM) que, tras su evaluación con más de 1.700 muestras ovinas de campo, demostró ser capaz de mejorar el rendimiento de los medios anteriores. Además, profundizando en la productividad de BSM para otras brucellae, se observó que tanto BSM como CM inhibían el crecimiento de una colección de cepas B. abortus bv1. El análisis de las posibles causas llevó al desarrollo un segundo medio selectivo denominado Brucella Selective Improved Culture (BruSIC) que resultó permisivo para todas las cepas de Brucella analizadas y tan inhibidor como CM para las bacterias contaminantes habituales en muestras veterinarias. BruSIC ofrece la ventaja adicional de no precisar suero bovino para el aislamiento de cepas de Brucella suero-dependientes, lo que simplifica la preparación del medio, abarata costes y evita el uso de compuestos de origen animal. En el capítulo 3, se analizó la seguridad y respuesta inmune inducidas en corderos inoculados con Rev1∆wzm, demostrando que se activa la formación de anticuerpos sin interferir en las pruebas serológicas estándar para el diagnóstico de la brucelosis. Estos resultados, más otros logrados por el grupo de investigación en ganado adulto y en ovejas gestantes, hacen de este mutante un prometedor candidato vacunal para el control de la infección por B. melitensis y B. ovis en pequeños rumiantes. El contenido de estos tres capítulos de tesis ha sido publicado en las revistas científicas Frontiers in Microbiology (grupo Frontiers) y Microbiology Spectrum (ASM).

  • English

    Brucellosis is a zoonotic disease caused by bacteria of the genus Brucella, that also entails large economic losses. The main infection source for humans are ruminants, in which the disease induces abortion and other reproductive disorders. In most affected regions, vaccinating animals is the only realistic strategy to control the infection. The attenuated strain B. melitensis Rev1 is the only recommended vaccine against ovine and caprine brucellosis, but it has several drawbacks, such as virulence when administered in pregnant animals, serological interference, possibility of infecting humans, and resistance to treatments including streptomycin, that urge the search for new vaccines. The smooth lipopolysaccharide (S-LPS) is a well-known virulence factor and the immunodominant antigen in diagnostic tests, thus, its modifications represent an interesting approach in the research for a safe vaccine. Among S-LPS biosynthesis pathways, the Wzm/Wzt two-component system is the responsible of transporting the O-PS synthesised onto the cytoplasmic side of the inner membrane to the periplasm, for its subsequent assembly to the core-lipid A to form the S-LPS. Blocking this pathway leads to the generation of rough LPS (R-LPS) mutants capable of accumulating O-PS within the bacteria, that may be decisive for an effective immune response against the infection. However, the biological implications of each transporter protein are still unknown. In particular, the O-PS blockage could lead to modifications in bacterial envelope, since the O-PS transport requires the participation of bactoprenol as a carrier molecule, that is also involved in the biosynthesis of other cellular structures. Aiming to deepen the knowledge about this system and its potential application in vaccines development, in Chapter 1 of this thesis, it is presented the construction and characterisation of single and double Δwzm/Δwzt mutants derived from Rev1. In addition, for comparative purposes, ∆wzm mutants were constructed from B. abortus 2308 and S19 and studied together with a 16M∆wzm mutant, derived from the B. melitensis 16M virulent strain previously developed in the Animal Health Group of the Institute of Agrobiotechnology (IdAB). As a result, the mutants lacking outer O-PS exhibited changes in gene expression, antigenic properties of inner O-PS, and phenotypic changes associated with outer membrane and/or cell wall modifications. In addition, Rev1 ∆wzm/∆wzt mutants were highly susceptible to polymyxins and other antibiotics used in human brucellosis treatment, particularly, to streptomycin; and they showed a large attenuation in mouse. Among them, Rev1∆wzm stood out for inducing a transient peak of splenomegaly, being highly immunogenic, and generating effective protection against B. melitensis and B. ovis virulent infections in murine model. In Chapter 2, prior to studying the safety of Rev1∆wzm in the natural host, it was determined the ability of this vaccine candidate to grow in Farrell (FM) and CITA (CM) selective culture media, currently recommended for Brucella primary isolation. The mutant strong susceptibility to polymyxins and the synergy between colistin and vancomycin observed led to the severe inhibition of the vaccine candidate in both selective media. To solve this, the named Brucella Selective Medium (BSM) was reformulated and evaluated with more than 1,700 ovine field samples, being able to improve the previous media performance. Furthermore, by exploring the productivity of BSM for other brucellae, it was observed that both BSM and CM inhibited the growth of a B. abortus bv1 strains collection. The analysis of the possible causes led to the development of a second selective medium called Brucella Selective Improved Culture (BruSIC), which was permissive for all the Brucella strains analysed, and as inhibitory as CM for the usual contaminant bacteria in veterinary samples. In addition, BruSIC offers the advantage of not requiring bovine serum to isolate serum-dependent Brucella strains, simplifying medium preparation, lowering costs and avoiding the use of compounds from animal sources. In Chapter 3, it was analysed the safety and immune response induced in lambs inoculated with Rev1∆wzm, demonstrating the activation of antibodies development without interfering in the standard serological tests for brucellosis diagnosis. These results, as well as others achieved by the research group in adult cattle and pregnant sheep, make this mutant a promising vaccine candidate to control B. melitensis and B. ovis infections in small ruminants. The content of these three thesis chapters has been published in the scientific journals Frontiers in Microbiology (Frontiers group) and Microbiology Spectrum (ASM).