Role of Ethylene and jasmonate on traits of agronomic interest in Cucurbita pepo: A genomic approach
- Autores: Gustavo Cebrián Castillo
- Directores de la Tesis: Manuel Jamilena Quesada (dir. tes.), José Miguel Guzmán Palomino (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Almería ( España ) en 2022
- Idioma: inglés
- Número de páginas: 257
- Títulos paralelos:
- Funciones del Etileno y Jasmonato en caracteres de interés agronómico en Cucurbita pepo: un enfoque genómico
- Tribunal Calificador de la Tesis: Adrián Rodríguez Burruezo (presid.), Jose Antonio Garrido-Cárdenas (secret.), Pedro Gómez Jiménez de Cisneros (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Agricultura Protegida por la Universidad de Almería
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: riUAL
- Resumen
- español
Cucurbita pepo es un cultivo hortícola económicamente importante a nivel mundial. El control genético de los rasgos morfológicos y fisiológicos que afectan la producción y la calidad de los cultivos es esencial para desarrollar programas de fitomejoramiento que mejoren, no sólo la producción de los cultivos o su tolerancia a los estreses bióticos y abióticos, sino también, los rasgos relacionados con la calidad, como la partenocarpia. En zonas semiáridas, los estreses abióticos, como la salinidad, se están convirtiendo en factores cada vez más importantes afectando, el desarrollo vegetativo y reproductivo y la producción de los cultivos. El etileno (ET) tiene un papel relevante y contrastante en las respuestas de las plantas a los estreses ambientales. En esta tesis, hemos analizado los efectos sobre la tolerancia a la sal, de tres mutaciones de ganancia de función, etr1a, etr1b y etr2b, que afectan a los receptores de ET, CpETR1A, CpETR1B y CpETR2B de Cucurbita pepo.
Se ha demostrado que los receptores de ET juegan un papel positivo en la tolerancia a la sal, mejorando la germinación, el establecimiento de plántulas y el posterior crecimiento vegetativo de las plantas. Los mutantes etr1b, etr1a y etr2b germinaron antes que WT bajo estrés salino y sus tasas de crecimiento en raíces y brotes, tanto en plántulas como en plantas, se vieron menos afectadas por la sal. Se encontró, que la respuesta de tolerancia a la sal en etr2b estaba asociada con una acumulación reducida de Na+ en brotes y hojas, así como una mayor acumulación de solutos compatibles, que incluyen; prolina, carbohidratos totales y compuestos antioxidantes. Además, varios genes que codifican transportadores de cationes monovalentes de membrana, como; intercambiadores de Na+/H+ y K+/H+ (NHX), antiportadores de salida de K+ (KEA), transportadores de alta afinidad de K+ (HKT) y transportadores de captación de K+ (KUP), también estaban altamente regulados por la salinidad en etr2b frente a WT. De acuerdo con ello, nuestros datos indican que la mayor tolerancia a la sal de etr2b está dirigida por la inducción de genes que excluyen el Na+ de los órganos fotosintéticos, al tiempo que mantienen la homeostasis de K+/Na+ y el ajuste osmótico. La mayor regulación positiva de los genes involucrados en la señalización de Ca2+ (CRCK) y la biosíntesis de ABA (NCED) en hojas de etr2b bajo estrés salino, nos indica que la función de los receptores de ET en la respuesta al estrés salino puede estar mediada por las vías de señalización de Ca2+ y ABA, siendo el ET un regulador negativo de la tolerancia a la sal en C. pepo.
El ET es también el regulador clave de la expresión (ES) y el determinismo sexual (DS) en las especies monoicas de la familia Cucurbitaceae. Esta hormona, no sólo controla la proporción de flores masculinas y femeninas en la planta, sino también el mecanismo que hace que cada meristemo floral se determine como una flor femenina o masculina. Esto último se logra deteniendo el desarrollo del estambre o el carpelo en las primeras etapas del desarrollo de la flor. Hasta la fecha, se han descrito que muchos de los diferentes genes de biosíntesis y señalización de ET regulan los rasgos ES y DS en cucurbitáceas. Sin embargo, la interacción entre ET y otras hormonas en la regulación del desarrollo floral es poco conocida. En esta tesis hemos analizado un nuevo mutante de EMS en C. pepo que se ve afectado en DS. La mutación convierte las flores femeninas en hermafroditas e interrumpe la tasa de crecimiento y la maduración de los pétalos y carpelos, lo que retrasa la apertura de las flores femeninas, promoviendo el crecimiento de los ovarios y con ello, el desarrollo partenocárpico de los frutos. La re-secuenciación del genoma completo permitió la identificación de la mutación causal del fenotipo, como una mutación sin sentido (G > A) en la región codificante de CpACO1A, un gen que codifica, una enzima ACO tipo I, la cual, comparte una alta identidad con C. sativus CsACO3 y C. melo CmACO1. El llamado aco1a redujo la actividad de ACO y la producción de ET en diferentes órganos donde se expresa el gen y redujo la sensibilidad a ET en las flores. CpACO1A y otros genes DS, incluidos, CpACO2B, CpACS11A y CpACS27A, mostraron una regulación de retroalimentación por ET de manera específica y temporal en los tejidos. Se descubrió que el ET y la regulación de retroalimentación positiva de CpACO1A, CpACO2B, CpACS11A y CpACS27A son responsables de determinar el destino del meristemo floral hacia una flor femenina, al promover el desarrollo de los carpelos y detener el desarrollo de los estambres. Además de su papel como hormona DS, el contenido de hormonas en aco1a sugirieron, que el papel positivo de ET en la maduración de los pétalos y la apertura de las flores, puede estar mediado por la inducción de la biosíntesis de ácido jasmónico (JA), mientras que su papel negativo en el crecimiento de los ovarios y el cuajado de los frutos podría estar mediado por su efecto represivo sobre la biosíntesis de auxinas (IAA).
En los últimos años, se ha descubierto que el JA es una hormona relevante en el desarrollo floral en numerosas especies, aunque, su función en el desarrollo floral de las cucurbitáceas y DS es desconocida. En esta tesis, se abordó la diafonía entre ET y JA en la regulación diferencial de la apertura de flores masculinas y femeninas y el desarrollo temprano de los frutos en Cucurbita pepo utilizando un nuevo mutante, lox3a, deficiente en JA, así como, los mutantes insensibles y deficientes en ET, aco1a y etr2b. La mutación EMS en lox3a suprimió la apertura de flores, tanto masculinas como femeninas, e indujo un desarrollo partenocárpico de los frutos. El análisis por BSA-seq y posterior mapeo fino, permitió la identificación de lox3a en el sitio de corte y empalme 5' del intrón 6 de CpLOX3A, un gen LIPOXIGENASA involucrado en la biosíntesis de JA. El contenido reducido de JA y la expresión disminuida de genes de biosíntesis (CpLOX3A, CpAOS1A y CpJAR1B) y señalización (CpJAZ1B, CpCOI1B y CpMYB21B) en flores masculinas y femeninas de lox3a, así como, el rescate del fenotipo lox3a mediante la aplicación externa de MeJA, demostraron que JA controla la elongación de pétalos y la apertura de las flores, así como, el aborto de los frutos en ausencia de fertilización. JA también rescató el fenotipo de los mutantes de ET, aco1a y etr2b, que son específicamente defectuosos en la apertura de las flores femeninas y el aborto de los frutos. Estos datos indican que el ET es inducido en las flores femeninas hacia la antesis, activando la producción de JA y promoviendo la apertura de la flor femenina y el aborto del ovario no fecundado. Dado que los ovarios de aco1a y etr2b retrasan su aborto hasta que las flores no alcanzan la apertura y el ovario de lox3a también aborta inmediatamente después de la apertura de la flor en respuesta a MeJA, proponemos, que la apertura de la flor puede actuar como un interruptor que desencadene el cuajado del fruto y desarrollo de los ovarios fertilizados, pero alternativamente, pueda inducir el aborto del ovario no fertilizado. Tanto el ET como el JA en los pétalos maduros y senescentes pueden servir como señales remotas que deciden el desarrollo alternativo del ovario y el fruto.
- English
Cucurbita pepo is an economically important horticultural crop worldwide. The genetic control of the morphological and physiological traits that affect crop production and quality is essential to develop breeding programs that improve not only crop production or tolerance to biotic and abiotic stresses, but also qualityrelated traits such as parthenocarpy.
In semiarid zones, abiotic stresses such as salinity are becoming increasingly important factors affecting both vegetative and reproductive development and crop production. Ethylene (ET) has a relevant and contrasting role in plant response to environmental stresses. In the present thesis, we have analysed the effects of three gain-of-function mutations, etr1a, etr1b and etr2b, affecting the ET receptors CpETR1A, CpETR1B and CpETR2B of Cucurbita pepo, on salt tolerance. It has been demonstrated that ET receptors play a positive role on salt tolerance, enhancing germination, seedling establishment, and subsequent vegetative plant growth. The mutants etr1b, etr1a, and etr2b germinated earlier than WT under salt stress, and root and shoot growth rates in both seedlings and plants were less affected by salt. The enhanced salt tolerance response of etr2b was found to be associated with a reduced accumulation of Na+ in shoots and leaves, as well as a higher accumulation of compatible solutes, including proline, total carbohydrates, and antioxidant compounds. Several genes coding for membrane monovalent cation transporters, Na+/H+ and K+/H+ exchangers (NHXs), K+ efflux antiporters (KEAs), high-affinity K+ transporters (HKTs), and K+ uptake transporters (KUPs) were also highly upregulated by salinity in etr2b versus WT. In addition, our data indicate that the enhanced salt tolerance of etr2b is led by the induction of genes that exclude Na+ from photosynthetic organs, while maintaining K+/Na+ homeostasis and osmotic adjustment. The higher up-regulation of genes involved in Ca2+ signalling (CRCKs) and ABA biosynthesis (NCED) in etr2b leaves under salt stress indicates that the function of ET receptors in salt stress response can be mediated by Ca2+ and ABA signalling pathways, being ET a negative regulator of salt tolerance in C. pepo.
ET is also the key regulator of sex expression (SE) and sex determinations (SD) in the monoecious species of the Cucurbitaceae family. This hormone not only controls the ratio of male to female flowers on the plant, but also the mechanism that makes each floral meristem to be determined as a female or a male flower. The latter is achieved by arresting the development of stamen or carpel primordia in early stages of flower development. Different ET biosynthesis and signalling genes has been reported to regulate SD and SE traits in cucurbits. However, the interaction between ET and other hormones in the regulation of flower development is poorly understood. In this thesis, we analysed a new C. pepo EMS mutant that is affected in SD. The mutation converts female into hermaphrodite flowers and disrupts the growth rate and maturation of petals and carpels, delaying female flower opening, and promoting the growth rate of ovaries and the parthenocarpic development of the fruit. Whole-genome resequencing allowed the identification of the casual mutation of the phenotype as a missense (G > A) mutation in the coding region of CpACO1A, a gene coding for a type I ACO enzyme that shares a high identity with C. sativus CsACO3 and C. melo CmACO1.The so-called aco1a reduced ACO activity and ET production in different organs where the gene is expressed, and reduced ET sensitivity in flowers. CpACO1A and other sex-determining genes, including CpACO2B, CpACS11A and CpACS27A, showed a feedback regulation by ET in a tissue- and temporal-specific manner. ET and the positive feedback regulation of CpACO1A, CpACO2B, CpACS11A, and CpACS27A was found to be responsible for determining the fate of the floral meristem towards a female flower by promoting the development of carpels and arresting the development of stamens. In addition to its role as a sex-determining hormone, other hormone contents in aco1a suggested that the positive role of ET on petal maturation and flower opening can be mediated by inducing the biosynthesis of JA, while its negative role on ovary growth and fruit set could be mediated by its repressive effect on IAA biosynthesis.
JA has been found to be a relevant hormone on flower development in numerous species, but its function in cucurbit floral development and SD is unknown.
Crosstalk between ET and JA in the differential regulation of male and female flower opening and in early fruit development in Cucurbita pepo was addressed by using the novel JA-deficient mutant lox3a and the ET-deficient and -insensitive mutants aco1a and etr2b. The EMS lox3a mutation suppressed both male and female flower opening, and induced the development of parthenocarpic fruit. A BSA-seq and fine mapping approach allowed the identification of lox3a in the 5'-splicing site of intron 6 in CpLOX3A, a LYPOXYGENASE gene involved in JA biosynthesis. The reduced JA content and diminished expression of JA biosynthesis (CpLOX3A, CpAOS1A and CpJAR1B) and signalling (CpJAZ1B, CpCOI1B and CpMYB21B) genes in male and female flowers of lox3a, and the rescue of lox3a phenotype by external application of MeJA, demonstrated that JA controls petal elongation and flower opening, as well as fruit abortion in the absence of fertilization. JA also rescued the phenotype of ET mutants aco1a and etr2b, which are specifically defective in female flower opening and fruit abortion. These data indicate that ET is induced in female flowers towards anthesis, activating JA production and promoting the aperture of the female flower and the abortion of the unfertilized ovary. Given that aco1a and etr2b ovaries delayed their abortion until the flower reached opening, and the lox3a ovary also aborted immediately after flower opening in response to MeJA, we proposed that flower opening can act as a switch that triggers fruit set and development in fertilized ovaries but may alternatively induce the abortion of the unfertilized ovary. Both ET and JA from mature and senescent petals can serve as remote signals that determine the alternative development of the ovary and fruit.
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