Bases estructurales de la especificidad de sustrato en éster-hidrolasas nativas y obtenidas por ingeniería supramolecular y de proteína

• Autores: Isabel Cea Rama
• Directores de la Tesis: Julia Sanz Aparicio (dir. tes.), Manuel Ferrer Martínez (codir. tes.), María Fernández Lobato (tut. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2022
• Idioma: español
• Número de páginas: 209
• Tribunal Calificador de la Tesis: Juan Antonio Hermoso Domínguez (presid.), Mario Mencía Caballero (secret.), Ana Beloqui Elizazu (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biociencias Moleculares por la Universidad Autónoma de Madrid
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen

  • Las éster-hidrolasas son una superfamilia de enzimas que rompen enlaces éster ampliamente utilizadas en la industria farmacéutica, entre otras. En esta Tesis Doctoral se han estudiado una serie de éster-hidrolasas de origen metagenómico y pertenecientes a las familias IV y VIII, de amplia especificidad de sustrato, en lo sucesivo promiscuas, y no estereoselectivas. Además de un dominio catalítico común, la familia IV muestra un dominio tapadera que modula el acceso al sitio activo, mientras que la familia VIII contiene un dominio de inserción que incluye elementos esenciales para la actividad. A través de la técnica de Cristalografía de rayos X, se ha resuelto la estructura tridimensional de estas enzimas analizando las bases estructurales asociadas a su elevada promiscuidad de sustrato y la forma de modularla.

    En primer lugar, se ha estudiado la éster-hidrolasa EH1AB1, a la que mediante ingeniería de proteínas se ha incorporado un segundo centro activo con actividad éster-hidrolasa (PluriZima).

    Se ha conseguido resolver la estructura con el segundo centro activo en complejo con un inhibidor suicida permitiendo corroborar su funcionalidad hidrolítica. Además, la mayor afinidad del sitio activo intrínseco por otro inhibidor suicida facilitó la incorporación de un complejo metálico creando una metalo-enzima con dos centros activos permitiendo abordar reacciones en cascada.

    En segundo lugar, se ha estudiado la éster-hidrolasa EH3, cuya estereoselectividad se ha evaluado mediante ingeniería de su nano-entorno por inmovilización y mutagénesis dirigida. Este análisis ha mostrado la participación preferente de un hemisferio de la proteína en su inmovilización. Así mismo, la resolución estructural del complejo con un inhibidor suicida permitió caracterizar el sitio activo, de manera que el aumento en estereoselectividad observado en la enzima inmovilizada puede deberse a una reorganización estructural de los residuos hidrofílicos ubicados en un bucle flexible del dominio tapadera. Además, el análisis estructural de los complejos de EH3S192A con dos enantiómeros de 2-fenilpropanoato de metilo permitió identificar residuos relevantes del sitio activo y diseñar mutantes con una elevada estereoespecificidad.

    Por otra parte, se ha caracterizado EH0, una éster-hidrolasa con una amplia especificidad de sustrato pese a presentar un túnel catalítico estrecho y accesible por una única entrada. Se ha visto que una alta flexibilidad del dominio tapadera es crucial para la actividad y promiscuidad de esta enzima. Simulaciones de dinámica molecular muestran residuos del dominio tapadera que pueden actuar como bisagras. El análisis estructural ha sugerido una serie de mutaciones, cuya influencia directa en la actividad y/o especificidad de sustrato se ha evaluado experimentalmente.

    Por último, la resolución estructural de la éster-hidrolasa EH7 en su forma nativa y en complejo con inhibidores suicidas permitió asignar la ubicación de la zona acilo/alcohol en la cavidad catalítica. Se han identificado residuos esenciales y generado mutantes con diferente actividad y especificidad frente a una amplia gama de sustratos, cuya hidrólisis no se había reportado para enzimas similares hasta la fecha.

    En resumen, esta Tesis describe las bases estructurales que rigen la especificidad de sustrato en éster-hidrolasas nativas y obtenidas por ingeniería supramolecular y de proteína.