Resumen de Isolation and design of diterpenoids from plectranthus species
- español
A pesar del gran desarrollo de la medicina, el cáncer continúa siendo una amenaza para la salud pública. Esta enfermedad es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial, y es por ello por lo que la investigación de nuevos agentes antitumorales debe continuar. Los productos naturales aislados de plantas medicinales representan la mayor fuente de nuevos compuestos bioactivos para combatir graves enfermedades como el cáncer. El género Plectranthus (Familia: Lamiaceae) comprende numerosas especies ampliamente distribuidas, empleadas tradicionalmente para el tratamiento de distintas enfermedades. Los cribados de citotoxicidad han identificado cuáles de las especies de Plectranthus pueden proporcionar posibles nuevos fármacos antitumorales, ya que son ricas en diterpenos los cuáles son responsables de varias actividades farmacológicas como la citotóxica.
En este proyecto, dieciséis plantas del género Plectranthus fueron estudiadas. Se prepararon extractos acetónicos mediante el método de extracción asistido por ultrasonidos (10% m/v). A continuación, se ensayó la actividad antimicrobiana, antioxidante, la toxicidad general y la citotoxicidad de los extractos previamente preparados. La actividad antimicrobiana de cada extracto fue estudiada frente a levaduras, bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. De los extractos estudiados, los de P. hadiensis y P. mutabilis fueron los más activos en el Método de Difusión por Pozos (Well Difussion Method). Empleando el método de microdilución, fueron determinados los valores de MIC (Minimal Inhibitory Concentration - Concentración Mínima Inhibitoria) y MBC (Minimal Bactericidal Concentration - Concentración Mínima Bactericida) de los extractos. Estos mostraron una actividad significativa frente a Staphylococcus aureus y Candida albicans con valores de MIC entre los 3.91 μg/mL y los 125 μg/mL y de MBC entre 62.5 μg/mL y 250 μg/mL.
La actividad antioxidante de los extractos fue determinada cuantitativamente usando el ensayo del difenilpicrilhidrazilo (DPPH). Los extractos de P. hadiensis y P. mutabilis mostraron las mayores actividades antioxidantes con unos valores de 46.14% y 36.24% respectivamente. La toxicidad general de todos los extractos fue determinada mediante el ensayo de letalidad con Artemia salina, y a continuación, la citotoxicidad del extracto más tóxico fue determinado, mostrando en ambos casos la mayor actividad los extractos de P. hadiensis y P. mutabilis. El análisis por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, High Liquid Column Chromatography) del extracto de hojas de P. hadiensisreveló que el conocido diterpeno abietano, 7-acetoxi-6- hidroxiroileanona (Roy) fue el compuesto mayoritario de este extracto. Roy fue aislada empleando Cromatografia en Capa Fina Preparativa y su actividad fue testada frente a la agresiva línea de cáncer de mama triple negativo MDA-MB-231S. Tanto el extracto de P. hadiensis como Roy redujeron la viabilidad de las líneas celulares de cáncer MDA-MB-231S, mostrando un valor de IC50 de 25.6 μg/mL y de 5.5 μM (2.15 μL/mL), sugiriendo que esta molécula principal podía ser la responsable de la bioactividad del extracto.
Por otro lado, fue realizado el estudio fitoquímico del segundo extracto bioactivo (P.
mutabilis). El fraccionamiento biodirigido del extracto acetónico previamente preparado mediante ultrasonidos resultó en el aislamiento de un nuevo nor-abietano diterpeno, (+)-(5S,10R)-10,11,12-trihidroxy-6,7-dioxo-20-nor-abieta-8,11,13-trieno (1), junto con otros tres diterpenoides de tipo abietano previamente conocidos Coleon-Uquinona (2), 8α,9α-epoxicoleon-U-quinona (3) y Coleon U (4). De los patrones de fragmentaión del análisis por ESI+ MS/MS, el compuesto (5) fue identificado en principio como un derivado acetoxi de un diterpeno abietano. El análisis por HPLC manifestó que Coleon U (96 ± 0.048 µg/mg) era el compuesto mayoritario del extracto de P. mutabilis entre las longitudes de onda analizadas y comparadas. Los datos in silico de estos compuestos indicaron una relación biosintética entre los compuestos 2,3 y 4. Estos resultados sugieren que tanto la quinona (2) como la epoxiquinona (3) se biosintetizaron directamente desde Coleon U (4). Coleon-U-quinona (2), 8α,9α-epoxicoleon-U-quinona (3) y Coleon U (4) fueron selectivos frente a las líneas celulares de cáncer y su efecto antitumoral no estuvo comprometido por la actividad P-gp en líneas celulares NCIH460/R. Cabe destacar que 2,3 y 4 fueron capaces de inhibir la actividad P-gp en células NCI-H460/R en una exposición larga de 72h, consiguiendo revertir consecuentemente la resistencia a Doxorrubicina (DOX) al emplear el tratamiento combinado compuesto aislado + DOX. El compuesto 1 fue inactivo frente a las tres líneas celulares ensayadas en un rango de concentración de 2 a 50 M. Ninguno de los compuestos aislados tuvo influencia en la expresión de ABCB1 en la línea celular NCI-H460/R, mientras que el extracto la incrementó significativamente. Este trabajo identificó los extractos de hojas de P. hadiensis y el extracto de P. mutabilis como fuentes potenciales para la obtención de nuevos compuestos bioactivos frente a la resistencia a múltiples fármacos (MDR, MultiDrug- Resistance) para el tratamiento del cáncer. El compuesto citotóxico previamente aislado de P. hadiensis 7α-acetoxi-6β-hidroxiroileanona, su derivado hemisintético 7α-acetoxi-6β-benzoiloxiroileanona (12BzRoy) y el compuesto 6,7- dehidroroileanona (DHR) aislado del aceite esencial de P. madagascariensis fueron empleados en este trabajo como los compuestos principales para la síntesis de nanopartículas de autoensamblaje. Los conjugados Roy-OA (OA, Oleic Acido- Ácido Oleico), DHR-sq (sq, Squalene- Escualeno) y 12BzRoy-sq fueron sintetizados con éxito y su nanoensamblaje fue caracterizado. Las nanopartículas (NPs) Roy-OA fueron las más prometedoras y fueron caracterizada en base a su tamaño (509.33 nm), PdI (0.249), potencial zeta (-46.2 mV) y morfología. El perfil de liberación de Roy fue determinado de las nanopartículas de Roy-OA a pH fisiológico de 7.4. La actividad biológica de las nanopartículas de DHR-sq y Roy-OA fue evaluada, y ambas tenían menor actividad que los compuestos de partida DHR y Roy respectivamente. Estos resultados ponen de manifiesto que los nanoensamblajes actúan como profármacos en la liberación de molécula citotóxicas.
- English
Despite the great development in human medicine, cancer is still a serious threat to public health. It is a well-known leading cause of morbidity and mortality worldwide, consequently, research on new anticancer agents ought to be continued. Natural products from medicinal plants represent a major resource of novel therapeutic substances for combating serious diseases including cancer. The Plectranthus genus (Family: Lamiaceae) represents a large and widespread group of species with a diversity of traditional uses for the treatment of several ailments. Cytotoxicity screenings have identified Plectranthus plants as potential sources of antitumor lead compounds. They are rich in diterpenoids which are reported to be responsible for various pharmacological activities such as cytotoxic activity.
In this project, sixteen plants from the Plectranthus genus were studied. The acetonic extracts were prepared by the ultrasound-assisted extraction method (10 % (w/v)). The prepared extracts were screened for their antimicrobial, antioxidant, general toxicity, and cytotoxicity. The antimicrobial activity of each extract was screened against yeasts, Gram-positive and Gram-negative bacteria. P. hadiensis and P. mutabilis extracts were the most active using the well diffusion method. Their MIC and MBC (microdilution method) were determined, and they possessed significant activity against Staphylococcus aureus and Candida albicans with MIC values ranging from 3.91 µg/mL to 125 µg/mL and MBC from 62.5 to 250 µg/mL.
The antioxidant activity of the extracts was quantitatively determined using the DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) scavenging radical assay. P. hadiensis and P. mutabilis extracts having the highest scavenging activities of 46.14% and 36.24% respectively. The general toxicity of all the extracts was determined using the Brine Shrimp Lethality assay (BSLA) and the cytotoxicity of the most toxic extract was determined. P. hadiensis and P. mutabilis we found to be the most bioactive and the compounds responsible for their bioactivity identified. The HPLC analysis of P. hadiensis leaves showed that the known abietane diterpene, 7α-acetoxy-6β-hydroxyroyleanone (Roy) was the major compound in this extract. Roy was isolated using preparative TLC and tested against the aggressive type triple-negative breast cancer (MDA-MB-231S). P. hadiensis extract and 7α-acetoxy6β-hydroxyroyleanone reduced the viability of MDA-MB-231S cancer cell line cells, showing an IC50 value of 25.6 µg/mL and 5.5 µM (2.15 µg/mL) respectively, suggesting that this lead molecule could be responsible for the bioactivity of this extract.
The phytochemistry of the second bioactive extract (P. mutabilis) was done. Bio-guided fractionation of ultrasound-assisted acetonic extract of P. mutabilis leaves resulted in the isolation of a new nor-abietane diterpene, (+)-(5S,10R)-10,11,12-trihydroxy-6,7- dioxo-20-nor-abieta-8,11,13-triene (1) alongside three known abietane-type diterpenoids Coleon-U-quinone (2), 8α,9α-epoxycoleon-U-quinone (3), and Coleon U (4). From the ESI+ MS/MS fragmentation patterns analysis, compound (5) was tentatively identified as acetoxy derivative of an abietane diterpenoid. HPLC analysis revealed Coleon U (96 ± 0.048 µg/mg) to be the major compound of the P. mutabilis extract in the wavelengths analyzed. Computational data indicates a biosynthetic relation between 2, 3, and 4. These results suggest that both the quinone (2) and the epoxyquinone (3) are formed directly from Coleon U (4).
Coleon U, coleon U quinone, and 8α,9α-Epoxycoleon U quinone were found to be selective towards the cancer cell lines and their anticancer effect was not compromised by P-gp activity in NCI-H460/R cells. Importantly, 2, 3, and 4 were able to inhibit P-gp activity in NCI-H460/R cells at longer exposure of 72 h and consequently revert doxorubicin (DOX) resistance in subsequent combined treatment. Compound 1 was inactive against all three cell lines in the range of concentrations (2 to 50 microM) tested.
All compounds did not influence the ABCB1 expression in NCI-H460/R cells, while the extract significantly increased it. This work identified P. hadiensis leaves and P. mutabilis extracts as a potential source of bioactive compounds to fight MDR. Cytotoxic 7αacetoxy-6β-hydroxyroyleanone previously isolated from P. hadiensis, its hemisynthetic derivative 7α-acetoxy-6β-benzoyloxyroyleanone (12BzRoy) and 6,7-dehydroroyleanone (DHR) isolated from the essential oil of P. madagascariensis were employed in the present work as lead molecules for the synthesis of self-assembled nanoparticles. RoyOA, DHR-sq, and 12BzRoy-sq conjugates were successfully synthesized and their nanoassemblies characterized. Roy-OA NPs were most promising and was characterized based on size (509.33 nm), Pdl (0.249), zeta potential (-46.2mV), and morphology. The release profile of Roy was determined from Roy-OA NPs at physiological pH 7.4. The biological activity of DHR.sq and, Roy-OA NPs were evaluated, and both were found to have less bioactivity when compared with DHR and Roy respectively. These results suggested that these nanoassemblies act as prodrugs for the release of cytotoxic lead molecules.
