Resumen de Desarrollo de nuevas técnicas de dilución isotópica estable y análisis masivo por espectrometría de masas aplicadas al estudio molecular de enfermedades cardiovasculares y al estado dinámico del redoxoma tiol
La Proteómica cuantitativa, que se define como el estudio de los cambios de expresión de un proteoma determinado, ha experimentado un gran desarrollo en los últimos años. Los métodos cuantitativos basados en espectrometría de masas constituyen una alternativa robusta frente a las técnicas basadas en electroforesis bidimensional. En este trabajo, presentamos un método de cuantificación masiva basado en el marcaje enzimático con 16O/ 18O y en un modelo estadístico novedoso que permite un análisis profundo de una gran variedad de proteomas. Esta tecnología se ha aplicado al estudio de los mecanismos moleculares implicados en la angiogénesis en el endotelio vascular, mediante el análisis de los cambios de expresión producidos por la estimulación de células endoteliales del cordón umbilical humano con el factor pro-angiogénico VEGF durante 4 y 8 h. Los resultados obtenidos sugieren que la técnica de marcaje con 18O y análisis posterior mediante espectrometría de masas en trampa iónica lineal, en combinación con un algoritmo que permite el control de la eficiencia de marcaje y un modelo estadístico robusto, constituye una alternativa semi-automática y prometedora para la realización de estudios de expresión diferencial de proteínas a gran escala mediante marcaje isotópico estable.
La Proteómica cuantitativa aplicada al estudio de las modificaciones redox (PTMOs) constituye aún un reto a nivel tecnológico, debido a la naturaleza lábil de algunas de las principales PTMOs a nivel de los grupos tiol, así como a la falta de herramientas para la identificación de los residuos modificados y el desarrollo tardío de los espectrómetros de masas de alta resolución. En esta tesis, se ha desarrollado un método simple y directo para el análisis de los cambios dinámicos que tienen lugar en el redoxoma, GELSILOX. Brevemente, los proteomas se someten a un proceso de doble alquilación que permite diferenciar el estado de oxidación de los residuos de cisteína, digestión en gel, marcaje diferencial con 16O/18O y separación mediante IEF seguido del análisis mediante espectrometría de masas en trampa iónica lineal. La técnica GELSILOX permite la cuantificación de los cambios de oxidación de los grupos tiol en un elevado número de péptidos utilizando un modelo estadístico novedoso, así como la identificación de la cisteína modificada y el análisis y cuantificación simultáneos del resto del proteoma en un mismo experimento. El método GELSILOX nos ha permitido caracterizar las principales dianas redox del peróxido de hidrógeno en células endoteliales y revela un aumento del estado de oxidación de los grupos tiol tras un período de hipoxia. Además, utilizando esta técnica, hemos detectado dianas redox modificadas tras procesos de isquemia-reperfusión en mitocondrias de corazón de rata, demostrando que dichas modificaciones son revertidas en animales que son sometidos previamente a precondicionamiento isquémico. Por otro lado, también se puede abordar el estudio del papel fisiológico de las especies reactivas de nitrógeno y oxígeno mediante el uso de técnicas de proteómica dirigida sobre la proteína de interés. En este trabajo, se aplicó la técnica de monitorización de iones de fragmentación específicos utilizando una trampa iónica lineal para demostrar que la CsA induce la nitración de la Tyr en posición 34 de la enzima MnSOD, ofreciendo una explicación bioquímica a la inactivación de la enzima y al efecto tóxico de la CsA.
