Desarrollo y aplicación de estrategias (bio) analíticas para la evaluación de la toxicidad asociada a nanopartículas de plata en modelos in-vitro e in-vivo

• Autores: María Nieves Fernández Muñiz
• Directores de la Tesis: María Riansares Muñoz Olivas (dir. tes.), José Luis Luque García (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Complutense de Madrid ( España ) en 2022
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: María Eugenia de León González (presid.), Jon Sanz Landaluce (secret.), Rafael Carlos Prados Rosales (voc.), Beatriz Fernández Garcia (voc.), Sonia Ramos Rivero (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Química Avanzada por la Universidad Complutense de Madrid
• Materias:
  • Química
    • Química analítica
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Docta Complutense
• Resumen
  • español

    En la actualidad, las AgNPs, debido a su fuerte actividad antimicrobiana, se utilizan en una gran variedad de productos de consumo, así como en aplicaciones biomédicas, lo que provoca que tanto los seres humanos como el medio ambiente estén cada vez más expuestos a estas nanopartículas. Concretamente, el tamaño de las AgNPs es una de las propiedades más importantes y un factor crítico en lo que se refiere a toxicidad. Por ello, la presente Tesis Doctoral ha evaluado mediante el desarrollo y aplicación de diferentes estrategias analíticas y proteómicas la posible toxicidad de estas AgNPs en un sistema in vitro e in vivo dependiendo de su tamaño.

    En el campo toxicológico la proteómica en combinación con la espectrometría de masas juega un papel fundamental ya que permite identificar y cuantificar una gran cantidad de proteínas en muestras biológicas complejas. Por esta razón, uno de los objetivos de la presente Tesis Doctoral consiste en diseñar un estudio proteómico para estudiar la toxicidad de las AgNPs y ver cómo esta difiere según el tamaño de nanopartícula empleado. En primer lugar, se han llevado a cabo varios ensayos de caracterización, viabilidad e internalización celular. A continuación, se han implementado con éxito dos estrategias de proteómica cuantitativa: SILAC y super-­¿SILAC, en células HepG2 y en larvas de pez cebra, respectivamente, permitiendo así elucidar los mecanismos de toxicidad de dichas nanopartículas de forma diferencial. Los resultados obtenidos demuestran que el tamaño de las AgNPs puede inducir la activación de mecanismos biomoleculares únicos y, por tanto, efectos específicos que no serían activados por las mismas AgNPs de tamaño de partícula diferente. Asimismo, se confirma que las AgNP10, debido a su pequeño tamaño, son capaces de internalizar en el núcleo, producir estrés nucleolar y daño al ADN y, como consecuencia, activar mecanismos de reparación del ADN dañado. Con respecto al modelo in vivo, las proteinas alteradas fueron mayoritariamente estructurales en ambos casos, lo que justifica alteraciones morfológicas e histológicas observadas durante el desarrollo embrionario y celular de las larvas expuestas a las AgNPs. Al igual que en el modelo in vitro, la alteración observada fue más acusada cuando se expusieron las larvas a las AgNPs de menor tamaño, corroborando así su mayor toxicidad.

    Para complementar los estudios proteómicos realizados en el sistema in vivo, se utilizó la técnica LA-­¿ICP-­¿MS con el fin de conocer la diferente distribución de las AgNPs en función de su tamaño en las larvas de pez cebra ya que puede aportar informacion adicional sobre sus mecanismos de toxicidad. En primer lugar, fue necesario previamente desarrollar un método de calibración y semi-­¿cuantificación, el cual, se basó, principalmente, en la utilización de una gelatina de pescado como matriz similar a la muestra de interés enriquecida con Au (III) en disolución como patrón interno. Para ello, se optimizaron los parámetros más habituales de esta técnica. A continuación, se hizo un estudio de distribución de los tres metales en la muestra de interés mediante la obtención de imágenes aplicando los parámetros anteriormente optimizados. Las imágenes obtenidas mostraron una mayor acumulación de las AgNPs más pequeñas a lo largo de todo el cuerpo de la larva mientras que las de mayor tamaño se acumularon en mucha menor medida y sólo en el área de la cabeza, confirmando así que el patrón de distribución era diferente según el tamaño de las nanopartículas. La mayor acumulación de las AgNP10 en las larvas concuerda también con los estudios proteómicos realizados en los cuales se demostró una mayor alteración proteica en las larvas expuestas a AgNP10, debido posiblemente a una mayor acumulación de las mismas. De esta forma, se confirma que las AgNP10 producen una mayor toxicidad en el organismo al igual que ocurría en las células.

  • English

    Nowadays, AgNPs, due to their strong antimicrobial activity, are used in a wide variety of consumer products as well as in biomedical applications, resulting in an increasing exposure of both humans and the environment to these nanoparticles. In particular, the size of AgNPs is one of the most important properties and a critical factor in terms of toxicity. For this reason, this Doctoral Thesis has evaluated the possible toxicity of these AgNPs depending on their size by developing and applying different analytical and proteomic strategies. For this purpose, an in vitro model (HepG2 cells) and an in vivo model (zebrafish larva) have been used.

    In the toxicological field, proteomics in combination with mass spectrometry plays a fundamental role as it allows the identification and quantification of a large number of proteins in complex biological samples. For this reason, one of the objectives of this PhD Thesis is to design a proteomic study to study the toxicity of AgNPs and to see how this differs according to the size of the nanoparticle used. First, several characterisation, viability and cell internalisation assays have been carried out. Then, two quantitative proteomics strategies, SILAC and super--SILAC, have been successfully implemented in HepG2 cells and zebrafish larvae, respectively, allowing us to elucidate the mechanisms of toxicity of these nanoparticles in a differential manner. The results obtained demonstrate that the size of AgNPs can induce the activation of unique biomolecular mechanisms and, therefore, specific effects that would not be activated by the same AgNPs of different particle size. It is also confirmed that AgNPs10, due to their small size, are able to internalise into the nucleus, produce nucleolar stress and DNA damage and, as a consequence, activate repair mechanisms of damaged DNA. With respect to the in vivo model, the altered proteins were mostly structural in both cases, which justifies the morphological and histological alterations observed during embryonic and cellular development of the larvae exposed to AgNPs. As in the in vitro model, the alteration observed was more pronounced when larvae were exposed to the smaller AgNPs, thus corroborating their greater toxicity. In this sense, while in larvae exposed to AgNP10 certain proteins related to apoptosis and cell cycle alteration were found, in larvae exposed to AgNP60 the alteration of proteins related to mitochondrial damage and induction of hypoxia was more pronounced, which in turn would be related to the generation of apoptosis and cell cycle alteration, while in larvae exposed to AgNP60 the alteration of proteins related to mitochondrial damage and induction of hypoxia was more pronounced.

    This, in turn, would be related to the generation of ROS and, ultimately, cell death. To complement the proteomic studies carried out in the in vivo