Resumen de Síntesis de nuevos glicósidos con actividad antitumoral y estudio del mecanismo de inhibición
INTRODUCCIÓN A partir de una serie de di-y monosacáridos, con actividad inhibitoria en cultivo de células de glioma humano U373 se selecciono el monosacárido NF115 para realizar experimentos in vivo, y fue capaz de inhibir el crecimiento de un tumor implantado en ratas sin observarse reacciones adversas clínicamente significativas. Aun cuando los resultados in vivo obtenidos con NF115 fueron muy positivos, era necesario el empleo de una alta dosis de compuesto lo que, hacia difícil su aplicación en animales superiores. Por tanto, decidimos obtener una nueva familia de glicósidos sobre la base de la estructura de NF115, con el fin de obtener nuevas moléculas con mejor actividad.
OBJETIVOS 1- Síntesis de una nueva familia de glicósidos derivados de NF115, con modificaciones en las posiciones 1,2,3 y 6 del anillo de glucosamina.
2- La actividad antimitótica de los nuevos compuestos sintetizados se ha ensayado en cultivos de glioma de rata (c6), glioma humano (U373) y en melanoma humano (A375).
3- Asimismo, se propuso conocer el modo de acción de los compuestos que resultasen más activos, sobre la hipótesis de que actuasen alterando el metabolismo de gangliósidos de las células tumorales: 3.1- Análisis del patrón de gangliósidos (HPLC) y ceramida (TLC) de células de glioma y melanoma cultivadas en presencia y ausencia de los inhibidores, 3.2- Se abordo la obtención de la enzima lactosilceramida sintasa, con el fin de ensayar la posible inhibición de esta enzima por los compuesto sintéticos.
3.3- Se registraron los espectros de 1H MAS NMR de las células tratadas con los inhibidores con el fin de conocer el efecto que producen los glicósidos sobre los metabolitos de estas células.
- Se abordo la síntesis de sistemas poliméricos bioactivos, para obtener sistemas de liberación controlada de los glicósidos.
METODOLOGÍA Síntesis de nuevos glicósidos.
Sobre la base de la estructura de NF115 se diseñaron nuevos compuestos que llevarían modificaciones en las posiciones 1,2,3 y 6 del anillo de glucosamina. La naturaleza de las modificaciones se concibieron atendiendo a los datos mas recientes sobre la estructura del inhibidor natural de la proliferación de astrositos, la neurostatina, el cual es un gangliósido.
De este modo y combinando los datos de NF115 y la estructura general de los gangliósidos, se sintetizaron los nuevos compuestos, que son glicósidos derivados de glucosamina con cadenas hidrocarbonadas de longitud variable en posición 1 y 2 que pueden contener un doble enlace en su estructura.
Asimismo se prepararon glicósidos con un anillo aromático separado del oxigeno anomérico por 1,2 ó 4 metilenos. Grupos alquilo hidroxilados se introdujeron en posición 6, derivados de pentaeritritol y glicerol. Finalmente, algunos derivados presentan un grupo sulfato en posición 6 o en su sustituyente, y en posición 3, con el fin de evaluar la importancia de la carga negativa, dado que los gangliósidos se caracterizan por tener residuos de ácido neuramínico cargados negativamente.
Estudio de la actividad antitumoral de los glicósidos.
Pasamos a estudiar su actividad antimitótica. La evaluación in vitro de los glicósidos se llevó a cabo en el grupo de Manuel Nieto- Sanpedro, en el Instituto Cajal (CSIC). La actividad se ensayo a diferentes concentraciones midiendo la incorporación de timidina tritiada sobre cultivos de las líneas celulares C6 (glioma de rata), U373 (glioma humano) y A375 (melanoma humano). De los datos obtenidos se extrajo información sobre la relación estructura-actividad para los nuevos antitumorales.
Estudio del mecanismo de acción de los glicósidos.
Una vez estudiada la actividad de los glicósidos, estudiamos el mecanismo de inhibición del crecimiento celular de los compuestos más activos, bajo la hipótesis que actuasen alterando el metabolismo de los gangliósidos. Se ha analizo el patrón de gangliósidos en líneas celulares de glioma y melanoma en presencia y ausencia de glicósidos antitumorales, así como el contenido total de gangliósidos utilizando HPLC. Dentro de este estudio se abordo el clonaje y la expresión heteróloga de la enzima lactosilceramida sintasa.
Se ha utilizado 1H MAS RMN para registrar los espectros de las células tratadas con los inhibidores con objeto de estudiar el efecto que estos producen sobre metabolitos celulares.
Unión del inhibidor a un polímero biodegradable, del que puede liberarse lenta y continuamente.
Se funcionalizó el glicósido activo mediante una esterificación enzimática selectiva, de forma que se obtuvo el monómero activo.
CONCLUSIONES - Se han sintetizado nuevos glicósidos derivados de glucosamina en base a la estructura del antitumoral NF115, que han sido evaluados como inhibidores del crecimiento de glicomas y melanomas. Se han obtenido una serie de compuestos con mejores actividades antimitóticas que NF115, uno de los glicósidos fue capaz de inhibir la división de melanoma humano con una ID50 por debajo de micromolar.
- Se ha obtenido información sobre la relación estructura-actividad para los glicósidos sintetizados, aportando nuevos datos, entre los que cabe mencionar que la actividad antimitótica esta asociada a la presencia de un grupo oleilo o una cadena alquílica larga en la posición C-1 del anillo de glucosamina.
- El estudio del patrón de gangliósidos y ceramida en células de glioma y melanoma tratadas con los glicósidos más activos, mostró que estos compuestos reducen ligeramente la producción total de gangliósidos en melanoma y en glioma. Producen una acumulación de ceramida de forma moderada.
- Se realizo el clonaje de una glicositransferasa especifica de la síntesis de gangliósidos, la enzima lactosilceramida sintasa, de Mus musculus en E. Coli, aunque no se logro obtener la proteína en su forma soluble.
- El estudio de los metabolitos de células de glioma tratadas con inhibidores, utilizando la técnica de 1h MAS RMN, revelo que los glicósidos producen un aumento de la concentración de metabolitos derivados de colina, y reducen la concentración de lípidos móviles. Los incrementos en los niveles de colina sugieren una posible inducción de apoptosis por los glicósidos.
- Se ha sintetizado enzimaticamente el monómero de uno de los glicósidos más activos, lo que ha permitido la síntesis de copolímeros hidrosolubles que liberan de forma controlada el inhibidor del crecimiento celular.
