Generación de modelos de leucemia pediátrica con expresión de NUP98-KDM5A en células pluripotentes humanas

• Autores: Joan Domingo Reinés
• Directores de la Tesis: Verónica Ramos Mejía (codir. tes.), David Landeira Frias (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2022
• Idioma: español
• ISBN: 9788411175098
• Número de páginas: 246
• Tribunal Calificador de la Tesis: César Nombela Arrieta (presid.), Sonia Perales Romero (secret.), Damia Romero Moya (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina por la Universidad de Granada
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
• Resumen
  • español

    La leucemia mieloide aguda (LMA) pediátrica es un desorden hematológico caracterizado por la proliferación descontrolada de células progenitoras mieloides en médula ósea. Está causada por alteraciones genómicas, muy frecuentemente translocaciones cromosómicas, que se producen durante el desarrollo fetal. Los tratamientos actuales no son efectivos en todos los pacientes y suelen ocasionar efectos secundarios a largo plazo, por lo que es de suma importancia conseguir nuevos tratamientos más específicos y eficaces. Falta mucho conocimiento sobre los mecanismos y el desarrollo de la LMA pediátrica debido en parte a baja disponibilidad de muestras de paciente y la limitada fidelidad de los modelos de la enfermedad. Una de las mayores incógnitas es la célula en la que se origina la mutación durante el desarrollo fetal. Por estos motivos, en esta tesis hemos planteado el uso de células pluripotentes humanas (hPSC) como base para la generación de un modelo de estudio de la LMA pediátrica. Las hPSC son células capaces de diferenciarse a cualquier tipo celular y pueden servir para el estudio de la hematopoyesis embrionaria. La translocación cromosómica t(11;12)(p15;p13) que produce el gen de fusión NUP98-KDM5A (NK5A) se encuentra exclusivamente en pacientes pediátricos con LMA. En esta tesis, se han desarrollado varios modelos de expresión de NK5A en hPSC. Utilizando el sistema CRISPR/Cas9 generamos hPSC con la translocación cromosómica t(11;12)(p15;p13), sin embargo, en el cultivo hubo una selección negativa de las células editadas y no fue posible su expansión y caracterización. A través de la expresión constitutiva de NK5A con vectores lentivirales se generaron líneas clonales de hPSC con distintos niveles de expresión de NK5A, que permitió el estudio del fenotipo de acumulación de aberraciones cromosómicas por errores en el proceso de mitosis. Sugerimos que estas mitosis aberrantes se producen por la interferencia de NK5A con las funciones del NUP98 endógeno, al interaccionar NK5A con la proteína RAE1, además de un aumento del daño en el ADN durante la mitosis. En este además observamos un bloqueo de la diferenciación en el mesodermo en las hPSC que expresan NK5A, sin llegar a producir células hematopoyéticas. Por último, se generó un modelo de expresión inducible por doxiciclina de NK5A en hPSC. Éste último modelo permitió expresar NK5A en distintos momentos de la diferenciación hematopoyética mostrando que dependiendo de la población en la que se expresa la proteína de fusión se produce un bloqueo en la diferenciación en distintas poblaciones, quedando clara su utilidad para identificar la célula de origen y los mecanismos de transformación de la LMA pediátrica causada por la expresión de NK5A.

  • English

    Pediatric acute myeloid leukemia (AML) is a hematologic disorder characterized by uncontrolled proliferation of myeloid progenitor cells in bone marrow. It is caused by genomic alterations, most frequently chromosomal translocations, which occur during fetal development. Current treatments are not effective in all patients and often cause long-term side effects, so it is of utmost importance to develop new, more specific, and effective treatments. Much knowledge about the mechanisms and development of pediatric AML is lacking due in part to low availability of patient samples and limited fidelity of disease models. One of the major unknowns is the cell in which the mutation originates during fetal development. For these reasons, in this thesis we have proposed the use of human pluripotent stem cells (hPSC) as the basis for the generation of a model for the study of pediatric AML. hPSC are cells capable of differentiating into any cell type and can be used to study embryonic hematopoiesis. The chromosomal translocation t(11;12)(p15;p13) producing the NUP98-KDM5A (NK5A) fusion gene is found exclusively in pediatric AML patients. In this thesis, several models with NK5A expression in hPSC have been developed. Using the CRISPR/Cas9 system we generated hPSC with the chromosomal translocation t(11;12)(p15;p13), however in culture there was a negative selection of the edited cells and expansion, and characterization was not possible. Through constitutive expression of NK5A with lentiviral vectors, clonal hPSC lines with different levels of NK5A expression were generated, which allowed the study of the phenotype of chromosomal aberration accumulation due to errors in the mitosis process. We suggest that these aberrant mitoses are caused by NK5A interference with endogenous NUP98 functions, by NK5A interacting with the RAE1 protein, in addition to increased DNA damage during mitosis. In this model we further observed a block of mesodermal differentiation in hPSC expressing NK5A, without producing hematopoietic cells. Finally, a model of doxycycline-inducible expression of NK5A in hPSC was generated. This last model allowed the expression of NK5A at different time points of hematopoietic differentiation. Depending on the population in which the fusion protein is expressed, a blockage in different populations. This model could be useful to identify the cell of origin and the mechanisms of transformation of pediatric AML caused by the expression of NK5A.