Resumen de Lipid-protein nanovesicles of membrane from "Brassica oleracea L. var. italica" as carriers of bioactive compounds
- español
El uso de nanotransportadores de compuestos bioactivos o fármacos se ha extendido en los últimos años debido a las ventajas que aportan en la industria cosmética y farmacéutica. El desarrollo de nuevos sistemas de encapsulación se está enfocando en la línea de obtener nanotransportadores de origen natural, como pueden ser las vesículas de membrana.
En esta tesis doctoral se plantea el desarrollo de un nuevo sistema de encapsulación para aplicaciones biotecnológicas basado en membranas celulares obtenidas de plantas de brócoli. El brócoli es un cultivo con un gran interés en España (cuarta productora a nivel mundial) y en la Región de Murcia, la cual contribuye con el 70 % de la exportación nacional de brócoli. Este tipo de cultivos generan una gran cantidad de residuos y/o subproductos, y dado a la escasez mundial de recursos y al problema que supone para el medio ambiente la gestión de los mismos, encontrar aplicaciones para ellos es necesario.
Durante los experimentos realizados en esta tesis, se emplearon vesículas de membrana obtenidas tanto de raíces como de hojas de brócoli para desarrollar e implementar su uso como nanotransportadores de compuestos bioactivos como el sulforafano en aplicaciones de la industria farmacéutica o cosmética relacionada con la piel. Se llevaron a cabo análisis fisicoquímicos, estudios proteómicos, análisis de microscopia, ensayos de estabilidad y de liberación in vitro, así como ensayos en cultivos celulares, en los cuales se realizaron ensayos de permeabilidad celular, citotoxicidad, expresión génica y de análisis de la producción de citoquinas inflamatorias, para determinar así la funcionalidad y aplicabilidad de las vesículas de membrana de brócoli con sulforafano encapsulado.
De los resultados obtenidos se puede determinar que las vesículas de membrana de brócoli tienen una alta eficiencia de encapsulación y una buena estabilidad en condiciones in vitro y cuando se introducen en una fórmula cosmética durante al menos un año. Además, relacionado con un aspecto crucial en las aplicaciones transdérmicas, se determinó que las vesículas pueden cruzar el estrato córneo, llegar a las capas internas de la piel y liberar los compuestos encapsulados en las células, produciéndose una interacción entre las membranas vegetales y humanas. Respecto a los ensayos con cultivos celulares, la aplicación de encapsulados de sulforafano reveló una importante actividad anti-proliferativa en células cancerígenas y una actividad antiinflamatoria en macrófagos.
Se observó una mejor absorción del sulforafano por las células de melanoma cuando se aplicaba en forma encapsulada en las vesículas de membrana, así como una inhibición del desarrollo celular, desencadenando además un aumento de la expresión génica de p53, el cual codifica para una proteína supresora de tumores. Por otro lado, en cuanto a la aplicación de los encapsulados de sulforafano en vesículas de membrana de brócoli en macrófagos humanos, los resultados mostraron una disminución de las interleucinas inflamatorias TNF-α, IL-1β e IL-6. De todos los ensayos realizados en la tesis, se concluyó además que las vesículas de membrana de brócoli tienen por si mismas una potente bioactividad, tanto anticancerígena como antiinflamatoria. Se determinó que contenían compuestos bioactivos como los isotiocianatos y proteínas antioxidantes, los cuales junto a los lípidos que conforman la estructura de las vesículas, determinan la actividad de las vesículas de membrana.
En conclusión, las vesículas de membrana de brócoli podrían incorporarse como un componente complementario o principal de formulaciones cosméticas o medicamentos de aplicación tópica para tratar trastornos de la piel relacionados con la inflamación y el estrés oxidativo. Podrían utilizarse como transportadores de otros compuestos o como bioactivos en sí mismas. Los resultados expuestos en esta tesis, dejan muchas líneas de investigación abiertas en las que seguir profundizando hasta obtener un sistema con potenciales aplicaciones en la industria biotecnológica.
- English
The use of nanocarriers of bioactive compounds or drugs has become more widespread in recent years due to the advantages they bring to the cosmetic and pharmaceutical industries. The development of new encapsulation systems focuses on obtaining nanocarriers of natural origin, such as membrane vesicles.
This PhD thesis proposes developing a new encapsulation system for biotechnological applications based on cell membranes obtained from broccoli plants. Broccoli is a crop of great interest in Spain (the fourth largest producer in the world) and in the Region of Murcia, which contributes 70% of the national export of broccoli. This type of crop generates a large amount of waste and by-products. Due to the worldwide scarcity of resources and the environmental problem of waste management, it is necessary to find applications for them.
During the experiments carried out in this thesis, membrane vesicles obtained from both broccoli roots and leaves were used to develop and implement their use as nanocarriers of bioactive compounds such as sulforaphane in skin-related pharmaceutical or cosmetic applications. Physicochemical analyses, proteomic studies, microscopy analyses, stability and in vitro release tests, as well as, cell culture assays were carried out. In the latter, cell permeability, cytotoxicity, gene expression, and inflammatory cytokine production assays were performed to determine the functionality and applicability of broccoli membrane vesicles with encapsulated sulforaphane.
From the results obtained, it can be determined that broccoli membrane vesicles have a high encapsulation efficiency and good stability under in vitro conditions and when introduced into a cosmetic formulation for at least one year. Furthermore, related to a crucial aspect in transdermal applications, it was determined that membrane vesicles are able to cross the stratum corneum, reach the inner layers of the skin and release the encapsulated compounds into the cells, resulting in an interaction between plant and human membranes. In cell culture experiments, the application of encapsulated sulforaphane revealed significant anti-proliferative activity in cancer cells and anti-inflammatory activity in macrophages. Enhanced uptake of sulforaphane by melanoma cells was observed when applied in the encapsulated form in membrane vesicles, as well as inhibition of cell proliferation and triggering an increase in gene expression of p53, which encodes for a tumour suppressor protein. On the other hand, regarding the application of sulforaphane encapsulated in broccoli membrane vesicles in human macrophages, the results showed a decrease in the inflammatory interleukins TNF-α, IL-1β, and IL-6. From all the assays performed in the thesis, it was further concluded that broccoli membrane vesicles themselves have potent bioactivity, both anticancer and anti-inflammatory. They were found to contain bioactive compounds such as isothiocyanates and antioxidant proteins, which along with the lipids that make up the structure of the vesicles, will determine the activity of the membrane vesicles.
Overall, broccoli membrane vesicles could be incorporated as a complementary or main component of cosmetic formulations or topically applied drugs to treat skin disorders related to inflammation and oxidative stress. They could be used as carriers for other compounds or as bioactive in their own right. The results presented in this thesis leave many lines of research open for further investigation until a system with potential applications in the biotechnology industry is obtained.
