Proteínas pluriempleadas de fagos inducen la transferencia horizontal de islas de patogenicidad en Staphylococcus aureus

• Autores: Ignacio Mir Sanchis
• Directores de la Tesis: José Rafael Penadés Casanova (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Cardenal Herrera-CEU ( España ) en 2012
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Manuel Espinosa Padrón (presid.), Carles Ubeda Morant (secret.), Fernando Rojo de Castro (voc.), Jaione Valle Turrillas (voc.), Wilhelmus Meijer (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Microbiología
  • Ciencias agrarias
    • Fitopatología
      • Bacterias
  • Ciencias médicas
    • Patología
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• Resumen

  • Staphylococcus aureus es una bacteria Gram positiva, de 0,5-­¿1,5 µm de diámetro, con forma de coco y que crece agrupada en forma de racimo debido a que el plano en el que la bacteria se divide cambia en la siguiente división. No presentan movilidad ni la capacidad de formar esporas, aunque sí son muy resistentes a la desecación, pudiendo crecer en ambientes con elevada concentración de sales. Poseen peptidoglicano y ácidos teicoicos en su pared celular, además de ser anaerobios facultativos y catalasa y coagulasa positivos. Todas estas características hacen que S. aureus sea un componente normal de la flora de la piel y mucosas de humanos y animales, lo que junto con su capacidad para producir una gran variedad de exoproteínas, hace que sea un patógeno oportunista, capaz de causar una gran variedad de cuadros patológicos, tanto en humanos como en animales. La infección por S. aureus se produce tras laceraciones cutáneas, traumáticas o quirúrgicas, a partir de las cuales la bacteria penetra de la piel a tejidos internos produciendo desde infección en dermis y tejidos blandos, hasta cuadros sépticos si llega al torrente sanguíneo, o cuadros como neumonía, endocarditis, artritis u osteomielitis, en función del tejido que consiga colonizar.

    ¿Qué permite a S. aureus infectar tan amplio rango de hospedadores y producir tan diverso número de procesos patológicos? Desde que Frederick Sanger secuenciara el genoma completo del fago phi X174 (Sanger et al., 1977) han pasado 35 años y se han secuenciado más de 2700 genomas completos del dominio Bacteria y más de 170 de Archaea (base de datos pública del NCBI). Toda la información generada ha supuesto una revolución en el campo de la microbiología. Así, nos ha hecho replantearnos el concepto de especie bacteriana, reorganizando la taxonomía y filogenia bacterianas (Woese et al., 1990). Asimismo, la secuenciación completa de genomas bacterianos nos ha permitido identificar dos grandes grupos de genes: el primero es un grupo altamente conservado responsable de procesos básicos celulares de metabolismo, crecimiento y multiplicación; el segundo grupo incluye genes facultativos que facilitan la adaptación a los cambios ambientales. Muchos de estos genes facultativos aparecen codificados en los llamados elementos genéticos móviles (EGMs). Dentro de los EGM se incluyen plásmidos, transposones, bacteriófagos, islas de patogenicidad, elementos conjugativos integrativos, así como cualquier grupo de genes con capacidad para transferirse de manera horizontal entre bacterias. La importancia de estos EGMs en la biología bacteriana se basa en el hecho de que se ha estimado que el 20% del contenido genético bacteriano en una especie determinada ha sido adquirido a partir de otro organismo por mecanismos de transferencia horizontal de genes (Gogarten et al., 2002). Por tanto, la transferencia horizontal de genes está involucrada en la adaptación microbiana a su nicho u hospedador (Viana et al., 2010), así como en la evolución de organismos tanto procariotas como eucariotas (Smith et al., 1992) (Monier et al., 2009).

    Desde el punto de vista de la patogénesis microbiana estos EGMs son de enorme importancia, ya que, y por poner un ejemplo, todas las toxinas responsables de un cuadro patológico definido están codificadas en EGMs (Tabla 1).

    Tabla 1. Enfermedades producidas por toxinas codificadas en elementos genéticos móviles.

    Organismo Toxina EGM Enfermedad Staphylococcus aureus TSST-­¿1 IP Síndrome del shock tóxico Staphylococcus aureus Enterotoxina A Profago Intoxicación alimentaria, TSS Staphylococcus aureus Enterotoxina B, C IP Intoxicación alimentaria, TSS Staphylococcus aureus Enterotoxina D Plásmido Intoxicación alimentaria, TSS Staphylococcus aureus Exfoliatina A Profago Síndrome de la piel escaldada Staphylococcus aureus Exfoliatina B Plásmido Síndrome de la piel escaldada Staphylococcus aureus Leucocidina Profago Neumonía necrotizante Streptococcus pyogenes SPEA,C Profago Fiebre escarlata Corynebacterium diphtheriae Toxina diftérica Profago Difteria Bacillus anthracis Toxina del ántrax Plásmido Antrax Vibrio cholerae Toxina del cólera Profago Cólera Sighella dysenteriae Toxina Shiga Profago Disentería Clostridium botulinum Toxina botulínica Profago Botulismo Clostridium perfringens Toxina Cpe Transposón Enterocolitis Clostridium tetani Toxina tetánica Plásmido Tétano Clostridium difficile Enterotoxina IP Enterocolitis Escherichia coli Toxina lábil (LT) Plásmido Diarrea Escherichia coli Toxina estable(ST) Transposón Diarrea Durante los últimos años, nuestro grupo de investigación se ha centrado en el estudio de los mecanismos de transferencia horizontal de genes implicados en virulencia, utilizando S. aureus como bacteria modelo. En esta bacteria, muchos de los factores de virulencia, resistencia a antibióticos y superantígenos descritos hasta la fecha están codificados en EGMs (Tabla 1). Así, la resistencia a meticilina y oxacilina se codifica en el elemento mo¿vil SCCmec (Katayama et al., 2000), el factor responsable de la neumonía necrotizante es la leucocidina de Panton-­¿Valentine (PVL), toxina codificada por un bacteriófago y que puede producir la muerte en 24 ¿ 48 horas (Gillet et al., 2002), mientras que otros superantígenos estafilocócicos causantes tanto de intoxicaciones alimentarias como del síndrome del shock tóxico, están causadas por toxinas codificadas en islas de patogenicidad (Novick, 2003), siendo estos dos últimos elementos móviles, los bacteriófagos y las islas de patogenicidad, el área de trabajo desarrollada en nuestro grupo de investigación.

    Biología de bacteriófagos.

    Los bacteriófagos o fagos son virus que infectan bacterias, utilizando parte de la maquinaria metabólica bacteriana para realizar su ciclo biológico. En función de la relación que estos virus adopten con sus células huésped, los bacteriófagos se clasifican en virulentos o atemperados. Los fagos virulentos matan a la célula hospedadora tras su infección, produciendo lo que se denomina ciclo lítico. Dicho ciclo lítico de replicación viral puede dividirse en diferentes etapas (Fig. 1), muchas de ellas comunes a virus eucarióticos:

    1. Unión (adsorción) del virión a una célula hospedadora susceptible. Esta unión se produce gracias al reconocimiento en la superficie bacteriana de una proteína receptora específica para el virus.

    2. Inyección (penetración) del material genético del virus al interior de la célula bacteriana.

    3. Replicación del material genético viral en el interior celular gracias a las maquinarias replicativas fágicas y de la célula hospedadora.

    4. Síntesis de las estructuras (envolturas) proteicas. Generación de procápsides.

    5. Empaquetamiento del genoma viral dentro de las procápsides y ensamblaje de la partícula vírica madura.

    6. Rotura de la bacteria y liberación de los viriones maduros de la célula.

    Figura 1. Representación esquemática del ciclo de replicación lítica de un virus bacteriano.

    Sin embargo, otros virus, aunque capaces de realizar un ciclo lítico, pueden llevar a cabo un ciclo de vida diferente, resultante de una relación genética estable con la célula hospedadora. Estos virus se llaman virus atemperados y pueden entrar en un estado llamado lisogenia. En dicho estado, el genoma del fago se denomina profago y está integrado en un lugar concreto del cromosoma bacteriano, denominado attB. En esta situación, la expresión por parte del fago de un represor hace que la mayoría de sus genes no se expresen, replicando su material genético en sincronía con el cromosoma bacteriano. Las bacterias que albergan virus atemperados se denominan lisógenas. La Figura 2 muestra el ciclo biológico de un fago atemperado.

    Figura 2. Representación esquemática del ciclo de replicación de un virus atemperado.

    (adaptación de Madigan, 12ª edición) El bacteriófago atemperado mejor estudiado es el bacteriófago lambda (¿) que infecta células de Escherichia coli. Tras la infección, el ciclo lítico del fago lambda está precedido por la expresión del gen cro que activa la expresión de los genes responsables de dicho ciclo (Johnson et al., 1978) (Schubert et al., 2007). Para que el fago ¿ cuando infecte a su hospedador pase a ciclo lisogénico es necesario que ocurran una serie de eventos: i) el gen represor global de los genes del virus debe expresarse. Dicho gen se denomina cI y como hemos dicho bloquea la expresión del gen cro y, por tanto, de la práctica totalidad de los genes del fago implicados en la replicación y empaquetamiento del mismo; ii) sin embargo, el represor cI controla su propia expresión y favorece además la expresión de otro gen importante necesario para que ocurra la lisogenia, la integrasa (Int). Esta proteína media la integración del genoma del fago en el attB del cromosoma bacteriano. Para que el estado de lisogenia se mantenga, el fago ¿ transcribe únicamente tres genes: rexA, rexB y cI. rexA y rexB previenen la superinfección por otros bacteriófagos (Snyder, 1995) , mientras que cI, como hemos mencionado, bloquea la transcripción de los genes necesarios para que se desarrolle el ciclo lítico (Little, 1984).

    Sin embargo, existen situaciones en las que el profago se induce, abandona su estado quiescente y pasa a su estado lítico (Fig. 2), donde en la mayoría de los casos la bacteria se lisa o muere. Dichas situaciones, como la exposición a luz ultravioleta o a determinados antibióticos, como los ß-­¿ lactámicos o las quinolonas (Favre et al., 1986, Miller et al., 2004, Phillips et al., 1987, Ubeda et al., 2005, Maiques et al., 2006), desencadenan la denominada respuesta SOS bacteriana, donde la proteasa RecA* de la bacteria estimula la autolisis del represor cI por un sitio específico alanina-­¿glicina, iniciándose el ciclo lítico de fago (Little, 1984, Kim & Little, 1993).

    Una vez iniciado el ciclo lítico, ya sea por infección o tras la inducción de los profagos residentes, la transcripción de los genes del fago se realiza de manera secuencial y ordenada. Este hecho se ve favorecido porque la organización genómica de estos elementos está estructurada en módulos, de manera que quedan agrupados en unidades transcripcionales genes con funciones relacionadas. Así, se pueden identificar los módulos de expresión temprana, intermedia y tardía (Fig. 3). El módulo de expresión temprana, en el que se encuentran los genes cI y cro, es crítico para que se desarrolle la lisis o la lisogenia; como se ha mencionado con anterioridad, la expresión de cro favorece el ciclo lítico, mientras que la expresión del represor cI favorece la lisogenia, al inhibirse la expresión de los módulos intermedio y tardío. El módulo de expresión intermedio codifica para proteínas implicadas en la replicación del fago. Finalmente, el módulo de expresión tardía codifica para proteínas implicadas en el empaquetamiento fágico y en la lisis bacteriana.

    Figura 3. Representación esquemática de la transcripción secuencial de los genes virales en el ciclo lítico (adaptación de Madigan, 12ª edición) Una vez el fago comienza su ciclo lítico, la replicación de su DNA es el primer punto crítico en el ciclo, seguido de la encapsidación y la lisis. Los bacteriófagos y los plásmidos han sido empleados como sistemas modelo para los estudios de diferentes modelos de replicación del DNA. En el caso de bacteriófagos, una forma típica de replicación es mediante la formación de círculo rodante, método también descrito en plásmidos (Khan, 1997), iniciándose la replicación por corte de una cadena como en el caso del colifago fd (Higashitani et al., 1994) o por desnaturalización de las dos cadenas como es el caso del fago lambda (Taylor & Wegrzyn, 1995). Otro tipo de inicio de la replicación de DNA lineal, se produce mediante la actuación de proteínas unidas covalentemente a los extremos del DNA, como es el caso de virus procariotas y eucariotas, así como de DNA genómico y de plásmidos lineales de especies de Streptomyces (Bao & Cohen, 2003).

    Dado que los bacteriófagos stafilocócicos estudiados en la presente tesis muestran gran similitud con el fago lambda, profundizaremos únicamente en la replicación del fago lambda y su relación con la célula hospedadora. Como hemos comentado la replicación del fago ¿ se inicia por desnaturalización de la doble cadena de DNA, y antes de que se produzaca la replicación por círculo rodante, el fago sigue un modo de replicación de tipo ¿ (theta) (Taylor & Wegrzyn, 1995). Este tipo de replicón (tipo ¿), en el que la horquilla de replicación avanza de manera bidireccional a lo largo de una molécula circular de DNA también ocurre en el caso de la replicación del DNA genómico de E.coli (Cairns, 1963), que contiene un único orígen de replicación denominado oriC (Meijer et al., 1979) y donde DnaA es la molécula iniciadora que reconoce el ori (Kohiyama, 1966) (Fuller et al., 1984) y es la responsable de desnaturalizar las dos cadenas (Fuller et al., 1984) así como de dirigir a la helicasa replicativa DnaB a la zona desnaturalizada (Marszalek & Kaguni, 1994). Posteriormente a estos eventos, DnaB recluta a la primasa DnaG, siendo ambas proteínas juntas las que promueven el ensamblaje del holoenzima DNA Pol III y la consecuente síntesis de las cadenas lider y rezagada del DNA cromosómico proteínas son sintetizadas por el fago mientras que otras son secuestradas a la célula hospedadora. Las proteínas sintetizadas por el fago son la proteína O y la proteína P (Taylor & Wegrzyn, 1995). La proteína O reconoce el origen de replicación ¿ (ori¿) y se une a él por su extremo amino terminal, mientras que por su extremo carboxi interacciona con la proteína P (Furth et al., 1978). La proteína P secuestra la proteína DnaB del hospedador formando el dímero P-­¿DnaB, que interacciona con el complejo ya formado ori¿-­¿proteína O, formándose un complejo multiproteico que es substrato para las chaperonas celulares DnaJ y DnaK que liberan la proteína P del complejo (Weigel & Seitz, 2006). DnaB unida ya al origen de replicación del fago ¿, recluta a la primasa DnaG de la bacteria, y ambas proteínas juntas promueven el ensamblaje del holonenzima DNA Pol III del hospedador y la consecuente síntesis de las cadenas líder y rezagada del fago ¿ en modo ¿. Los cebadores sintetizados por DnaG son eliminados por la actividad exonucleasa 5¿¿3¿ de la enzima PolA y los espacios generados son rellenados por desoxirribonucleótidos por la misma enzima PolA y sellados por la enzima ligasa. El superenrollamiento negativo es introducido por la enzima girasa, mientras que la separación de los genomas circulares entrelazados como dos eslabones de cadena es realizado por la enzima topoisomerasa IV. Todas estas enzimas involucradas en el proceso: PolA, ligasa, girasa y topoisomerasa IV son secuestradas a la célula hospedadora (Weigel & Seitz, 2006).

    Para que la replicación del fago lambda pase de tipo ¿ a círculo rodante (también llamada replicación ¿ -­¿ sigma-­¿ por su imagen en microscopía electrónica) deben producirse unas reacciones de recombinación que pueden estar mediadas por enzimas codificadas en el fago o por enzimas codificadas por la bacteria (Stahl et al., 1997). El cambio de ¿ a ¿ se inicia con la interrupción del avance de la horquilla de replicación. Con la horquilla detenida se produce la rotura de la doble cadena por una endonucleasa, y se degrada la cadena rezagada por enzimas con actividad 5¿¿3¿ codificadas en el fago y en el hospedador (Weigel & Seitz, 2006) de manera que queda una porción libre de cadena sencilla que es substrato para las proteínas de alineación de cadena sencilla (SAP) codificadas por el fago o para la proteína hospedadora RecA (Stahl et al., 1997). La cadena sencilla que ha sido linealizada con su hebra complementaria se desplaza fuera de la estructura circular generando la estructura tipo sigma. El corte inicial de las dos cadenas resulta controvertido, y algunos autores defienden que la detención de la horquilla genera la formación de la intersección de Holiday por alineación de las nuevas hebras sintetizadas (Seigneur et al., 1998), de manera que proteínas con actividad resolvasa de la intersección de Holliday tipo RusA o Rap emergen como nucleasas candidatas para el corte inicial de la doble cadena (Sharples, 2001). El paso de replicación ¿ a replicación ¿ supone la formación de concatémeros lineales del genoma fágico, los cuales son substrato para la subunidad pequeña de la terminasa del fago ¿, que corta el concatémero por sitios cos específicos e introduce el genoma del fago más un poco genoma extra en las procásidas (Sippy & Feiss, 2004).

    coli, apenas se conoce nada sobre la biología de los fagos que infectan S. aureus. Como anteriormente hemos comentado, en ocasiones los profagos son portadores de factores de virulencia (Tabla 1), de manera que la presencia de este tipo de fagos juega un papel importante en la patogénesis bacteriana siendo en algunas ocasiones el responsable del cuadro patólógico (Brüssow et al., 2004). Es por ello, que el estudio de los módulos de replicación de los fagos estafilocócicos ¿11 y 80¿, será un tema a desarrollar en la futura tesis.

    Biología de islas de patogenicidad de S. aureus.

    Además de nuestro interés en la biología de los fagos de S. aureus, nuestro grupo centra sus esfuerzos en la caracterización de un nuevo grupo de elementos genéticos móviles: las islas de patogenicidad de S. aureus, (SaPIs). Las SaPIs son segmentos cromosomales discretos de un tamaño variable de unas 16 Kpb, que contienen genes que codifican toxinas, como la toxina del síndrome del shock tóxico (TSST1) u otros superantígenos (Lindsay et al., 1998), factores de virulencia o de adaptación al hospedador (Viana et al., 2010). En la figura 4 podemos observar la estructura de una isla modelo, SaPIbov1.

    Figura 4. Representación esquemática de los genes pertenecientes a la isla SaPIbov1. Las flechas representan la orientación y tamaño de las diferentes pautas abiertas de lectura. Código de colores: amarillo, escisión-­¿integración; azul, regulación; naranja, función desconocida; púrpura, replicación; rojo, origen de replicación (oriS);azul claro, proteína de interferencia con el fago pif; verde, encapsidación (verde claro, subunidad pequeña de la terminasa terS); rosa, superantígenos y otros genes accesorios; attL y attR, secuencias de repetición izquierda y derecha respectivamente. (Novick, 2010) Cuando se introduce en el gen tst un marcador de resistencia antibiótica, se pueden realizar estudios de transferencia horizontal de estos elementos. Dichos estudios consisten en infectar con un fago o inducir con mitomicina C un profago de una cepa que sea SaPI-­¿positiva (Tabla 2). En estos experimentos se observan diferentes posibilidades: i) el profago no activa el ciclo biológico de la isla y ésta se transfiere de manera basal, como es el caso de ¿12 y SaPIbov1 (Tabla2), ii) el profago sí activa el ciclo biológico de la isla y esta se transfiere con una alta frecuencia igualando su transferencia al título del fago que la ha inducido; es más, en estas situaciones el título de fago se reduce comparado con el título de fago cuando la cepa es SaPI negativa, indicando que la relación entre ambos elementos es una relación de parasitismo donde la isla se beneficia y el fago se perjudica, como ocurre en los casos ¿80¿, ¿11 y ¿147 con la isla SaPIbov1 (Tabla 2).

    Tabla 2. Título de fago y frecuencia de transducción de cepas lisogénicas SaPIbov1-­¿positivasa.

    Cepa donadora fago SaPI Transducción (Título)b Título fagoc RN27 ¿ 80¿ -­¿ -­¿ 1.2 x 1010 JP44 ¿ 80¿ SaPIbov1 2.3 x 108 5.7 x 108 JP46 ¿ 12 SaPIbov1 1.2 x 103 ND RN451 ¿ 11 -­¿ -­¿ 3.3 x 109 JP47 ¿ 11 SaPIbov1 2.7 x 106 7.5 x 106 RN782 ¿ 147 -­¿ -­¿ 1.3 x 1010 JP48 ¿ 147 SaPIbov1 3.0 x 106 2.7 x 109 a. Tabla obtenida de Úbeda 2005.

    b. No. de transductantes de SaPIbov1 tst::tetM x ml de cultivo inducido, usando la RN981 (recA-­¿) como cepa aceptora.

    c. No. de calvas de fago x ml de cultivo inducido, usando a la RN4220 como cepa aceptora.

    Por otro lado, la relación existente entre fagos e islas puede estudiarse mediante experimentos de replicación de isla (Lindsay et al., 1998, Ubeda et al., 2005). Cuando se exponen a mitomicina C cepas no lisogénicas SaPI-­¿positivas o cepas lisogénicas de fagos que no activan el ciclo de la SaPI (JP46), no se observa replicación de la isla (Fig. 5), sin embargo con cepas lisogénicas que transducen la isla con una elevada frecuencia, JP44, JP47 y JP48, sí se observa replicación de la isla (Fig. 5). Dicha replicación se observa en los Southern blots porque aparece señal de hibridación de la sonda con el ¿bulk¿ de ADN así como con una banda (L) que migra por delante del ¿bulk¿ de ADN y correponde a monómeros de isla lineales (Fig. 5). El mecanismo por el cual unos fagos estimulan el ciclo de la isla y otros no lo hacen, se desconoce, y será una línea de investigación en la futura tesis.

    Figura 5. A y C. Inducción de la replicación de SaPIbov1 por exposición de la cepa JP1996 (A) (RN4220, SaPIbov1 tst::tetM) y JP44 (C) (RN27, lisogénica para el fago 80¿, SaPIbov1 tst::tetM) respectivamente, a Mitomicina C. El cultivo bacteriano se creció a 32ºC, tomándose muestras a los 30, 60, 90 y 120 min para la extracción de su DNA, el cual fue separado mediante electroforesis en gel de agarosa, teñido con bromuro de etidio y fotografiado. B y D. Southern blot de las muestras mostradas en A y C, hibridación o.n. con una sonda específica para SaPIbov1. E. Especificidad de inducción de SaPIbov por los fagos ¿11, ¿147 y ¿12 de muestras obtenidas a los tiempos indicados tras la adición de mitomicina C. F. Southern blot de las muestras mostradas en E, hibridadas con sonda específica de SaPIbov1 (Ubeda et al., 2005).

    Trabajos previos de nuestro grupo (Ubeda et al., 2007b, Ubeda et al., 2008) (Tormo et al., 2008) pusieron de manifiesto una serie de características relativas a las SaPIs, utilizando como isla modelo SaPIbov1 (Fig. 4). Las SaPIs, al igual que los fagos, tienen una organización modular, de manera que genes que pertenecen a mismos módulos tienen funciones relacionadas. Los módulo de las SaPIs son: escisión-­¿integración; regulación; replicación y encapsidación.

    Módulo de escisión-­¿integración: En los estudios iniciales donde se caracterizó SaPI1 se observó que su integrasa era suficiente y necesaria para la integración del elemento en el sitio attB bacteriano. Sin embargo, SaPI1 sólo escindía tras la infección o inducción de un fago que eliminase la represión de Stl, sugiriendo que se necesitaba un factor adicional (escisionasa, Xis) para mediar la escisión de la isla del cromosoma bacteriano. Dado que la isla no escindía de forma espontánea se pensó que Xis estaba codificada en el fago inductor (Ruzin et al., 2001).

    similares, reveló que estos elementos podían escindir de manera espontánea, hasta el punto que tras crecer la bacteria toda la noche, una de cada 200 bacterias había perdido la isla (Ubeda et al., 2003). Esta característica las diferenciaba de SaPI1 y sugería que o bien sus integrasas poseían además actividad escisionasa, pudiendo escindir el elemento per se, o estas islas codificaban para una escisionasa.

    La caracterización del proceso de escisión de la isla, así como la caracterización de las regiones mínimas necesarias para este proceso será uno de los objetivos de la tesis.

    Módulo de regulación: consiste en dos genes (SaPIbov1_ORF20 y SaPIbov1_ORF19) cuya orientación es divergente, tal y como ocurre con los genes cI y cro del bacteriófago lambda (Johnson et al., 1978). La ORF20 (stl) es el represor global de la isla. Su expresión bloquea el ciclo de la isla, y hace que el elemento se encuentre en estado quiescente integrado en el genoma bacteriano. Cuando el gen stl es delecionado, la isla escinde y replica de manera autónoma (Ubeda et al., 2008). Stl, aún teniendo homología funcional con el reprsor cI del fago lambda, no contiene el sitio específico alanina-­¿glicina autoproteolítico, tal y como poseen cI y LexA, de manera que la respuesta SOS per se no activa el ciclo de la isla (Fig. 5 A-­¿B). Sin embargo, el ciclo de la isla sí se activa tras la infección con ciertos fagos estafilocócicos o mediante la inducción de profagos por adición de mitomicina C o antibióticos (Fig. 5 C-­¿ D y E-­¿F) (Ubeda et al., 2005), sugiriendo que el único papel del fago en el proceso de activación de la isla es la eliminación de su represor, Stl. El proceso molecular por el cual ciertos fagos son capaces de eliminar la acción del represor Stl de la isla y otros fagos no son capaces, ha constituido el principal foco de estudio del presente trabajo.

    Módulo de replicación: Como hemos comentado anteriormente, la única función del fago para que la isla comience su ciclo ERP es la eliminación del represor de la isla Stl. Una vez la isla escindida comienza a replicar, lo hace gracias a las ORF 13-­¿14 y ORF 15 que codifican para proteínas con actividad helicasa y primasa respectivamente (Ubeda et al., 2008, Ubeda et al., 2007a). Dichas proteínas junto con el ori, consideradas la unidad replicativa, funcionan de manera inestable cuando son clonadas en un plásmido suicida en E.coli (Ubeda et al., 2007a) sugiriendo que el replicón de este elemento genético móvil está diseñado para funcionar extracromosómicamente, cuando la isla se transfiere horizontalmente. Esto explica el hecho de que el modo de vida de la isla en la bacteria hospedadora es intracromosómico, si se encuentra escindida del cromosoma, la isla replica descontroladamente y supone un perjuicio para la bacteria (Ubeda et al., 2008).

    Módulo de encapsidación: cuando la isla es activada por la infección de un fago o por la inducción de un profago residente, esta comienza el ciclo denominado escisión-­¿circularización-­¿ empaquetamiento (ERP, acrónimo inglés excision-­¿replication-­¿packaging). La isla se empaqueta en 2008). Además la isla ha desarrollado una elegante estrategia para parasitar dichas proteínas: gracias a proteínas codificadas en la isla, ésta consigue remodelar las procápsides fágicas acorde a su menor tamaño (el de la isla), de manera que solamente su genoma puede rellenar dichas procápsides y generar partículas maduras portadoras de isla (Fig. 6) excluyendo así el genoma fágico (Ruzin et al., 2001) (Ubeda et al., 2005) (Tallent et al., 2007) (Tormo et al., 2008). Dichas cápsides pequeñas son las responsables de la visualización de la banda (L) de DNA que migra por delante del bulk de DNA en los geles de agarosa y Southern blots en los casos en que hay inducción de la isla (Fig. 5)(Ruzin et al., 2001, Ubeda et al., 2005).

    Figura 6. Microscopía electrónica de un lisado del fago 80¿, obtenido de Úbeda 2005.

    Aumento 122000x.

    Todos estos módulos, la estrecha relación que las SaPIs tienen con los fagos estafilocócicos, el estilo de vida de las SaPIs en definitiva, indica que las islas están tremendamente diseminadas en estafilococos. La secuenciación completa de un gran número de cepas de S.aureus ha puesto de manifiesto que efectivamente las SaPIs están absolutamente distribuidas, pues todas las cepas secuenciadas poseen una o varias islas en su genoma, indicando que dichos elementos juegan un importante papel en la biología de estas bacterias. Tanto es así que nuestro grupo ha demostrado que las islas de patogenicidad juegan un papel fundamental en la adaptación al hospedador en S.aureus(Viana et al., 2010). La figura 7 muestra una relación de las SaPIs encontradas en cepas pertenecientes al género Staphylcoccus.

    Figura 7. Representación esquemática de Islas de Patogenicidad en el género Staphylococcus. Las flechas representan la orientación y el tamaño de las diferentes pautas abiertas de lectura. El código de colores es el mismo que en la figura 4. (Novick, 2010) Además de la amplia distribución de las islas dentro de los estafilococos, nuestro grupo y otros autores han demostrado la transferencia de estos elementos entre distintas especies bacterianas. Así, Maiques et al. (2007) demostraron la transferencia de SaPIbov2 de Staphylococcus aureus a Staphylococcus epidermidis, y más recientemente Chen and Novick (2009) transfirieron SaPI1 y SaPIbov1 a Listeria monocytogenes. Estos resultados sugieren que el rango de hospedadores de fagos y SaPIs puede ser más amplio de lo que se pensaba hasta el momento. De hecho el estudio in silico en busca de estos elementos en géneros diferentes a Staphylococcus, ha revelado la presencia de elementos similares en Streptococcus, Enterococcus y Lactococcus (Fig. 8), permitiendo ampliar la familia que estas islas cromosómicas conforman, denominándose PRCIs, acrónimo anglosajón de phage-­¿related chromosomal Islands.

    Figura 8. Representación esquemática de diferentes PRCIs. El código de colores es el mismo que para la figura 4. (Novick, 2010) Dada la estrecha relación que muestran entre sí estos elementos genéticos móviles, fagos e islas, dada la marcada tendencia que tienen para diseminarse y dada la importancia que implica su presencia tanto en la biología de las bacterias que los albergan como en el desarrollo de enfermedades al ser humano y a los animales, decidimos ampliar nuestro conocimiento a cerca de estos importantes elementos.

    Los objetivos que nos planteamos en la tesis son:

    Descubrir el proceso molecular por el que determinados fagos estafilocócicos inducen el ciclo ERP (escisión-­¿replicación-­¿empaquetamiento) de las SaPIs favoreciendo la diseminación horizontal de factores de patogenicidad.

    Caracterizar la/s proteína/s encargada/s de la escisión de las islas de patogenicidad de Staphylcoccus aureus, así como las regiones implicadas en dicho proceso.

    Caracterizar los módulos de replicación de dos fagos estafilocócicos, ¿11 y fago 80¿.

    Para la consecución de los objetivos nombrados anteriormente se han utilizado técnicas básicas de biología molecular, entre las que cabe destacar:

    METODOLOGÍA GENERAL Bacterias, plásmidos y medios.

    Las cepas usadas en este estudio son Staphylococcus aureus y Escherichia coli. Los cultivos de S.aureus se crecieron rutinariamente a 32ºC, 37ºC o 43ºC en TSA o en TSB (Scharlau) y se guardaron como glicerinados a -­¿75ºC. Se añadió los antibióticos eritromicina (20 µgr ml-­¿1 o 2,5 µgr ml-­¿1 ), tetraciclina (3 µgr ml-­¿1), cloranfenicol (20 µgr ml-­¿1) o el producto Xgal (20 mg ml-­¿1) (Roche), cuando fue conveniente.

    Se usó caldo Luria-­¿Bertani para cultivar cepas de Escherichia coli. Para mantener las construcciones en E. coli se utilizaron los antibióticos ampicilina (100 µgr ml-­¿1), kanamicina (50 µgr ml-­¿1).

    Manipulaciones del DNA.

    Mediante procedimientos estándar (Sambrook et al., 1989) se realizaron todas las manipulaciones de DNA. El DNA plasmídico se extrajo de S. aureus utilizando el kit mini-­¿prep de Sigma siguiendo el protocolo del fabricante, excepto que las bacterias se lisaron previamente con lisostafina (Sigma; 12,5 µgr ml-­¿1) a 37ºC durante 1 hora. Los plásmidos obtenidos de E.coli se transformaron en estafilococos mediante electroporación (Cucarella et al., 2001). Para la manipulación del DNA todas las enzimas de restricción necesarias se obtuvieron de MBI Fermentas, Roche y Amersham. Los cebadores se obtuvieron de Invitrogen Technologies.

    En la hibridación mediante Southern blot, se obtuvo DNA cromosómico y se separaró mediante gel de electroforesis de agarosa. Los geles se tranfirieron a membranas de nylon (Hbond-­¿N 0.45 mm de diámetro de poro; Amersham Life Science) utilizando métodos estándar (Sambrook et al., 1989). El marcado de la sonda y su hibridación con el DNA se realizó de acuerdo al protocolo aportado por el kit de marcado de DNA PCR-­¿DIG y detección de quemiluminiscencia (Roche).

    Ensayo de la ß -­¿lactamasa En el plásmido pCN41, se construyeron las fusiones transcripcionales del gen ß-­¿lactamasa (lacZ) con los genes cuya expresión se pretendía estudiar.

    METODOLOGÍA UTILIZADA EN LOS ESTUDIOS DE INDUCCIÓN DE FAGOS Y SaPIs Inducción de profagos.

    El ciclo lítico de los fagos que se encuentran en estado latente en la bacteria puede inducirse mediante la aplicación de sustancias que activen la respuesta SOS. Para obtener un lisado de una cepa lisogénica, se realizaró una dilución 1/50 en TSB de un cultivo estacionario y se crecerió hasta alcanzar una OD540 = 0,35. Seguidamente se añadió mitomicina C (2µgr ml-­¿1). Posteriormente los cultivos se crecieron en agitación lenta (80 rpm) a 32ºC. La lisis ocurrió sobre las 4 h. Antes de la aparición de la lisis se tomaron muestras (1ml) del cultivo inducido a distintos tiempos y se extrajo su DNA (ver apartado de extracción de DNA). Los lisados obtenidos se filtraron en filtros de 0,2 µm para eliminar aquellas bacterias que no hubieran sido lisadas. Posteriormente estos lisados se guardaron a 4ºC hasta su uso.

    Titulación de fagos.

    Para cuantificar el número de partículas fágicas que contiene un lisado se diluyó un cultivo estacionario de la cepa RN4220 (sensible a la mayoría de los fagos de S. aureus) 1/50 en TSB y se creció hasta alcanzar una OD540 = 0,4. Se infectaró 50 µl de este cultivo con 100 µl de diluciones seriadas en phage buffer del lisado a temperatura ambiente durante 5 minutos, tras los cuales, la mezcla de fagos y bacterias se sembraron mediante siembra en profundidad en placas de ¿phage base¿ (25 gr de Nutrient Broth Nº2, Oxoid; 7gr de agar). Las placas se incubaron a 37ºC durante toda la noche. Al día siguiente se cuantificaron el número de calvas producidas por el fago y se multiplicaró por el factor de dilución.

    Transducción.

    Para estudiar el proceso de transferencia de una SaPI se utilizaron los lisados obtenidos mediante el método de inducción que se ha comentado anteriormente con la particularidad que las cepas utilizadas contenían la isla en estudio integrada en su genoma. Cabe destacar que las SaPIs contienen un marcador genético que confiere resistencia a tetraciclina a la bacteria, lo cual nos permite estudiar la transferencia de estas islas. El derivado SaPIbov1 tst::tetM que contiene el gen marcador tetM incluido en el gen tst de SaPIbov1 fue proporcionado por Ross Fitzgerald (Fitzgerald et al., 2001). El marcador tetM en la isla SaPIbov2 fue generado por nuestro grupo (Úbeda et al.,2003). Las otras SaPIs fueron proporcionadas por Richard Novick.

    Se realizaron diluciones seriadas de estos lisados en phage buffer. Cien microlitros de estas diluciones o bien del lisado sin diluir se añadieron a 1 ml de bacterias aceptoras crecidas hasta OD540=1.4. La mezcla del lisado con las bacterias se incubó a 37ºC durante 20 minutos para dar tiempo suficiente al fago a penetrar en la bacteria. Posteriormente mediante siembra en profundidad utilizando placas de TSA con tetraciclina se incubó a 37ºC durante toda la noche. Estas placas deben contener Citrato Sódico (17 mM) para impedir que el fago lisara las bacterias. Se utilizaron las cepas RN4220 o RN981 (RecA-­¿) como bacterias aceptoras.

    CONCLUSIONES En respuesta a los objetivos planteados al inicio de este trabajo, hemos obtenido las siguientes conclusiones:

    1. ProteÍnas pluriempleadas de fagos actu¿an como antirrepresores induciendo la transferencia de islas de patogenicidad de Staphylococcus aureus.

    2. La especificidad de induccio¿n existente entre fagos e islas se debe a que cada isla requiere de un inductor fa¿gico especi¿fico. Aquellos fagos que no posean dicho antirepresor no sera¿n capaces de activar el ciclo de dicha isla.

    3. Las protei¿nas inductoras son necesarias y suficientes para desencadenar el ciclo escisio¿n-­¿ replciacio¿n empaquetameinto (ERP) de las islas, debido a que eliminan la accio¿n represora de Stl.

    4. El mecanismo molecular de induccio¿n de las islas de patogenicidad se produce por interaccio¿n protei¿na-­¿protei¿na entre el antirrepresor codificado por el fago y el represor Stl codificado por la isla.

    5. Debido a un proceso evolutivo, la secuencia de los inductores ha ido variando de forma que han aparecido varientes ale¿licas, las cuales poseen diferentes capacidades de induccio¿n de las islas.

    6. Las islas de patogenicidad codifican protei¿nas con actividad escisionasa (Xis) las cuales participan junto con la integrasa en el proceso de escisio¿n y transferencia de las SaPIs.

    7. La expresio¿n de la escisionasa no afecta la estabilidad de la protei¿na integrasa ni inhibe la alta transferencia de la isla.

    8. La transferencia de islas de patogenicidad por fagos que no inducen la replicacio¿n de la isla esta¿ mediado por un proceso en el que intervienen la integrasa y la escisionasa codificadas en la isla.

    9. El represor global de las islas, Stl, controla la escisio¿n de la isla al controlar la expresio¿n tanto de las integrasas como de las escisionasas de las SaPIs.

    10. El mo¿dulo de replicacio¿n del fago 80¿ corresponde al tipo iniciador-­¿cargador de helicasa (IC), cuyo sistema modelo es el colifago lambda.

    11. El fago ¿11 posee un mo¿dulo de replicacio¿n con una estructura nunca antes descrita, donde intervienen la protei¿na iniciadora (que alberga el origen de repliacio¿n), la protei¿na helicasa y dos pequen¿as protei¿nas con funcio¿n desconocida pero esenciales para la replicacio¿n del fago.