Estudio del ensamblaje del tallo ribosómico de Saccharomyces cerevisiae caracterización de las interacciones de sus componentes

• Autores: David Bolívar Cardenas Sanjur
• Directores de la Tesis: Miguel Remacha Moreno (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2008
• Idioma: español
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• Resumen

  • I. INTRODUCCIÓN 7 I.1 EL RIBOSOMA Y EL TALLO RIBOSÓMICO 8 I.1.1 FUNCIONES BÁSICAS DEL RIBOSOMA 8 I.1.2 COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DEL RIBOSOMA 8 I.1.3 CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES DEL RIBOSOMA 9 I.1.4 GENERALIDADES DEL TALLO RIBOSÓMICO 10 I.2 EL TALLO RIBOSÓMICO DE Saccharomyces cerevisiae 11 I.2.1 COMPONENTES DEL TALLO 11 I.2.1.1 Proteínas ácidas 11 I.2.1.1.1 Aspectos estructurales 11 I.2.1.1.2 Acetilación N-terminal específica de las proteínas P1 13 I.2.1.1.3 Reservorio citoplásmico e intercambio con el ribosoma 13 I.2.1.1.4 Función biológica 13 I.2.1.2 Proteína P0 15 I.2.1.2.1 Aspectos estructurales 15 I.2.1.2.2 Función biológica 17 I.2.2 CARACTERÍSTICAS DEL TALLO 18 I.2.2.1 Estructura y estequiometría del complejo 18 I.2.2.2 Estabilidad del complejo 19 I.3 FOSFORILACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DEL TALLO RIBOSÓMICO 19 I.3.1 SITIOS DE FOSFORILACIÓN 20 I.3.2 PROTEÍNA-QUINASAS INVOLUCRADAS EN LA FOSFORILACIÓN 20 I.4 PAPEL FUNCIONAL DEL TALLO RIBOSÓMICO COMO REGULADOR DE LA TRADUCCIÓN EN ORGANISMOS EUCARIÓTICOS 21 I.4.1 EQUILIBRO ENTRE SUBPOBLACIONES RIBOSÓMICAS 21 I.4.2 ACTIVIDAD DE LAS SUBPOBLACIONES RIBOSÓMICAS 23 I.5 ENSAMBLAJE DEL TALLO RIBOSÓMICO DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE: INTERACCIONES DE LOS COMPONENTES DEL TALLO 24 I.5.1 ESTUDIOS SOBRE EL ENSAMBLAJE DEL TALLO RIBOSÓMICO 24 I.5.2 INTERACCIONES CON OTRAS PROTEÍNAS CELULARES EN LA FRACCIÓN CITOSÓLICA 25 I.5.3 INTERACCIONES ENTRE LAS PROTEÍNAS ÁCIDAS EN LA FRACCIÓN CITOSÓLICA 26 I.5.4 INTERACCIONES DE LAS PROTEÍNAS ÁCIDAS CON LA PROTEÍNA P0 EN EL RIBOSOMA 27 I.5.4.1 Estudio del sitio de interacción de la proteína P0 en las proteínas ácidas 27 I.5.4.2 Estudio de los sitios de interacción de las proteínas ácidas en la proteína P0 27 OBJETIVOS 29 II. MATERIALES Y MÉTODOS 31 II.1 MATERIAL BIOLÓGICO 32 II.1.1 CEPAS DE Escherichia coli 32 II.1.2 CEPAS DE Saccharomyces cerevisiae 32 II.2 PLÁSMIDOS 34 II.3 MEDIOS DE CULTIVO 36 II.3.1 MEDIOS DE CULTIVO PARA Escherichia coli 36 II.3.2 MEDIOS DE CULTIVO PARA Saccharomyces cerevisiae 36 II.4 OLIGONUCLEÓTIDOS 37 II.5 ENZIMAS Y REACTIVOS 38 II.5.1 ENZIMAS 38 II.5.2 REACTIVOS 38 II.6 MÉTODOS DE TRANSFORMACIÓN CELULAR 38 II.6.1 TRANSFORMACIÓN DE Escherichia coli 38 II.6.2 TRANSFORMACIÓN DE Saccharomyces cerevisiae 39 II.7 MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 40 II.7.1 OBTENCIÓN DE ADN PLASMÍDICO DE Escherichia coli 40 II.7.2 OBTENCIÓN DE ADN GENÓMICO DE Saccharomyces cerevisiae 40 II.7.3 OBTENCIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN A PARTIR DE GELES DE AGAROSA 40 II.7.4 ESTRATEGIAS DE CLONAJE 40 II.7.4.1 Obtención de la construcción de la proteína P2ß etiquetada con el TAP en su extremo carboxilo 41 II.7.4.2 Obtención de las construcciones de las formas truncadas de la proteína P0 41 II.8 TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS 43 II.8.1 ELECTROFORESIS DE ADN 43 II.8.2 ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS 43 II.8.2.1 SDS-PAGE 44 II.8.2.2 Electroforesis bidimensional IEF/SDS-PAGE 44 II.8.2.3 Isoelectroenfoque de proteínas 45 II.9 TÉCNICAS DE TINCIÓN DE GELES 45 II.9.1 TINCIÓN CON NITRATO DE PLATA 45 II.9.2 TINCIÓN CON SYPRO RUBY 45 II.10 OBTENCIÓN DE FRACCIONES SUBCELULARES DE Saccharomyces cerevisiae 46 II.10.1 OBTENCIÓN DE EXTRACTO CITOPLASMÁTICO (FRACCIÓN S30) 46 II.10.2 OBTENCIÓN DE RIBOSOMAS CRUDOS Y FRACCIÓN CITOSÓLICA (FRACCIÓN S100) 46 II.10.3 OBTENCIÓN DE RIBOSOMAS LAVADOS A PARTIR DE RIBOSOMAS CRUDOS 46 II.11 CUANTIFICACIÓN DE MUESTRAS 47 II.11.1 MUESTRAS DE ADN 47 II.11.2 MUESTRAS DE RIBOSOMAS 47 II.11.3 MUESTRAS DE PROTEÍNAS 47 II.12 PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS CITOSÓLICAS DE Saccharomyces cerevisiae MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD 47 II.12.1 PROTEÍNAS ETIQUETADAS CON UNA COLA DE SEIS RESIDUOS DE HISTIDINAS 47 II.12.2 PROTEÍNAS ETIQUETADAS CON TAP 48 II.13 ELECTROTRANSFERENCIA E INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS TRANSFERIDAS A MEMBRANA (WESTERN-BLOT) 49 III. RESULTADOS 51 III.1 INTERACCIONES DE LAS PROTEÍNAS ÁCIDAS EN EL CITOSOL 51 III.1.1 INTERACCIONES DE LAS PROTEÍNAS ÁCIDAS CON OTRAS PROTEÍNAS CELULARES 51 III.1.1.1 Purificación mediante la cola de histidinas 51 III.1.1.1.1 Comparación de la purificación de los complejos con las cuatro proteínas ácidas 51 III.1.1.1.2 Purificación de las proteínas que interaccionan con la proteína P2ß acumulada en el citosol 55 III.1.1.1.3 Identificación de las proteínas diferenciales por espectrometría de masas 57 III.1.1.2 Purificación mediante el epítopo TAP 58 III.1.1.2.1 Generación de la cepa que expresa la proteína P2ß etiquetada con el TAP 59 III.1.1.2.2 Purificación de los complejos de la proteína P2ßTAP 60 III.1.2 INTERACCIONES ENTRE LAS CUATRO PROTEÍNAS ÁCIDAS 63 III.1.2.1 Purificación mediante la cola de histidinas 63 III.1.2.2 Purificación mediante el TAP 65 III.2 ESPECIFICIDAD DE UNIÓN DE LAS PROTEÍNAS ÁCIDAS A LOS SITIOS DE INTERACCIÓN DE LOS HETERODÍMEROS P1¿-P2ß Y P1ß-P2¿ EN LA PROTEÍNA P0 66 III.2.1 CONSTRUCCIÓN DE LAS FORMAS TRUNCADAS DE LA PROTEÍNA P0 CARENTES DE LOS SITIOS DE UNIÓN DE LAS PROTEÍNAS ÁCIDAS 66 III.2.1.1 Obtención de las formas truncadas mediante PCR 67 III.2.1.2 Clonaje de las formas truncadas en los vectores de expresión 67 III.2.2 GENERACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LAS CEPAS MUTANTES NULAS CONDICIONALES 68 III.2.2.1 Generación de las cepas condicionales dGP0 confirmación mediante PCR y fenotipo de crecimiento 68 III.2.2.2 Caracterización de las cepas mutantes condicionales expresando las diferentes formas de la proteína P0 71 III.2.3 ANÁLISIS DE LA UNIÓN DE LAS PROTEÍNAS ÁCIDAS A LA PROTEÍNA P0 72 III.2.3.1 Análisis de unión de las proteínas ácidas en los mutantes nulos condicionales 73 III.2.3.2 Análisis comparativo de la abundancia de las proteínas ácidas en el citosol entre los diversos mutantes condicionales 75