Resumen de Rac1 regula la endocitosis y la tensión de membrana plasmática mediante el control de los niveles de PI(4,5)p2 y la dinámica de actina
Resultados previos del grupo habían revelado la existencia de una endocitosis tubular independiente de clatrina y dependiente de Arf6, que era regulada por la actividad de Rac1 a través de su control de los niveles de PI(4,5)2 y de proteínas relacionadas con el citoesqueleto como la actina, la cortactina, la miosina-II o sorprendentemente ROCK (efector por excelencia de RhoA, proteína antagonista de Rac1). También se había demostrado que estos túbulos contienen β1-integrina y que podrían alterar la vía de reciclaje de esta proteína. Sin embargo, se desconocía el mecanismo molecular por el cual Rac1 controla la formación de túbulos, inhibiéndolos cuando se encuentra en estado activo.
En este contexto, el primer objetivo de esta tesis ha sido confirmar el papel de los PI(4,5)P2 en la generación de las invaginaciones tubulares y estudiar por inmunofluorescencia las principales proteínas que regulan el citoesqueleto en la vía de Rac1, con tal de profundizar en el mecanismo por el cuál Rac1 inhibe los túbulos. En este sentido, hemos revelado que Rac1 induce la translocación de cortactina a la periferia celular, lo que consiguientemente produce una polimerización de actina en esta localización. Por otro lado, se ha demostrado que Rac1 también provoca el reclutamiento cortical de miosina-IIA a través de ROCK, asociándose esta miosina-IIA con la F-actina y constituyendo una red de actomiosina en la membrana plasmática. De hecho, se ha observado mediante el ensayo pull-down que ROCK1 puede interaccionar con Rac1 activo. Por lo tanto, se ha hipotetizado que Rac1 activo impide la formación de túbulos en la membrana plasmática a través del control de los niveles de PI(4,5)P2 y de la generación de una red cortical de actomiosina (con un papel de su nuevo efector ROCK1), la cual a través de aumentar la tensión de membrana evita que ésta pueda invaginarse. El segundo objetivo de la tesis ha consistido en analizar la posible participación de esta nueva vía Rac1/ROCK en la migración celular, ya que el citoesqueleto de actomiosina tiene un papel fundamental en este proceso. Para estudiarlo, hemos generado líneas estables de células HT-1080 que expresan diferentes mutantes de Rac1 (tanto los que interaccionan con ROCK como el que no). No obstante, no hemos podido demostrar de forma clara un papel relevante de la interacción entre Rac1 y ROCK en la movilidad celular, ni a través del ensayo de cierre de herida o wound healing ni el de la cámara de Boyden o transwells.
Finalmente, en el tercer objetivo de la tesis se ha estudiado la función de Rac1 mediante su control de los niveles de PI(4,5)P2 y la dinámica de actina (los cuales influían en la regulación de las invaginaciones tubulares) en un sistema de estiramiento celular. En este sistema, las células se estiran (stretching) y seguidamente se libera el estiramiento (release), apareciendo de forma pasiva unos reservorios de membrana (reservoirs) que ayudan a acomodar el exceso de membrana que se genera en estas condiciones. Posteriormente, estos reservoirs son reabsorbidos de forma activa y hemos demostrado que Rac1, precisamente a través de regular los niveles de PI(4,5)P2 y la polimerización de actina, regula este proceso de reabsorción ayudando a la recuperación de la tensión basal de membrana. El papel específico de estas proteínas en el proceso deja una puerta abierta a una posible cascada de mecanotransducción iniciada por estas proteínas en las localizaciones en las que se reabsorben los reservoirs.
