Resumen de Genome Mining of the Strain Streptomyces sp. CA-170360: Identification and Heterologous Expression of Secondary Metabolite Biosynthetic Gene Clusters
- español
La aparición de cepas patógenas resistentes a antibióticos, especialmente bacterias Gramnegativas, ha aumentado enormemente en los últimos años, comprometiendo la eficacia de los antibióticos usados hasta el momento. Por ello, la búsqueda de nuevas moléculas con actividad antimicrobiana se ha convertido en una tarea indispensable. Históricamente, los actinomicetos, sobre todo las especies del género Streptomyces, han sido una de las grandes fuentes de nuevos antibióticos. La cepa Streptomyces cacaoi CA-170360, perteneciente a la colección microbiana de Fundación MEDINA, produce una familia de nuevos ciclopentapéptidos, las pentaminomicinas A-H, junto con los ya conocidos antibióticos BE-18257, también ciclopentapéptidos, con una moderada actividad frente Acinetobacter baumannii. Esta cepa, además, produce cacaoidina, el primer lantipéptido de clase V (lantidina) descrito, con actividad frente a patógenos Gram-positivos, como Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) y Clostridium difficile. El genoma de esta cepa fue secuenciado y analizado, llegando a identificar las rutas biosintéticas responsables de la producción de ambas familias de compuestos, así como otras de rutas de biosíntesis de metabolitos secundarios ya conocidos y detectados en las fermentaciones de la cepa. Las pentaminomicinas A-H y los antibióticos BE-18257 son dos familias de ciclopentapéptidos sintetizados por dos sintetasas de péptidos no ribosomales (NRPS) independientes pero codificadas conjuntamente en la misma ruta biosintética (cpp). La ruta carece de un dominio tioesterasa necesario para la ciclación y liberación de los pentapéptidos, pero contiene una proteína aislada tipo PBP con un dominio beta-lactamasa conservado (CppA) aguas arriba de la primera NRPS. La expresión heteróloga de la ruta cpp en el hospedador Streptomyces albidoflavus J1074 confirmó que es la responsable de la biosíntesis tanto de las pentaminomicinas A-H como de los antibióticos BE-18257, y la generación del mutante por reemplazamiento génico del gen cppA demostró su implicación en la liberación y ciclación de ambas familias de pentapéptidos. La cacaoidina es un nuevo lantipéptido glicosilado con unas características estructurales no descritas hasta el momento, como un número inusualmente elevado de D-aminoácidos, un anillo de lantionina dimetilado (NMe2Lan), no encontrado en otros lantipéptidos, y una O-glicosilación de un residuo de tirosina con un disacárido no descrito hasta la fecha en ningún otro producto natural, formado por α-L-ramnosa y β-L-6-deoxigulosa. Las diferentes herramientas predictivas disponibles no fueron capaces de identificar la ruta biosintética responsable de la producción de cacaoidina, que se localizó usando la secuencia C-terminal de aminoácidos y encontrando el gen estructural en el genoma. Finalmente, la ruta cao se delimitó mediante análisis BLAST y de predicción de estructuras secundarias HHPred. Su expresión heteróloga en S. albidoflavus J1074 confirmó que es la ruta responsable de la producción de cacaoidina y llevó a la identificación de una nueva variante de cacaoidina, glicosilada con un disacárido diferente que tiene dos átomos menos de oxígeno (cacaoidina-2O). La generación de mutantes en el hospedador heterólogo nos permitió asignar las funciones de diferentes genes en la biosíntesis de cacaoidina: el gen cao4 participa en la doble metilación del residuo de Ala en el extremo amino-terminal, y los genes cao8 y cao16 son dos glicosiltransferasas que trabajan de forma cooperativa en la glicosilación del residuo de Tyr. Finalmente, la generación de aglicón se consiguió mediante la hidrólisis ácida controlada de cacaoidina-2O.
- English
The emergence of antibiotic resistant pathogenic strains, especially Gram-negative bacteria, has seriously increased in the last decades, endangering the efficiency of the antibiotics used thus far. As a result, the discovery of new molecules with potential antimicrobial activity has become an essential matter. Historically, actinomycetes, particularly species from the genus Streptomyces, have been one of the most prolific sources of novel antibiotics. The strain Streptomyces cacaoi CA-170360 from the microbial collection of Fundación MEDINA produces the novel cyclic pentapeptides pentaminomycins A-H, alongside the already known cyclic pentapeptides BE-18257 antibiotics, with a moderate antibacterial activity against Acinetobacter baumannii. This strain also produces cacaoidin, the first member of the new class V lanthipeptides (or lanthidins) RiPP family, with bioactivity against Gram-positive pathogens, such as Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Clostridium difficile. The genome of this strain was sequenced and analyzed, and the biosynthetic gene clusters responsible of the production of these compounds were identified, together with other biosynthetic gene clusters involved in the production of different known secondary metabolites detected in the fermentations of this strain. Pentaminomycins A-H and BE-18257 antibiotics are two different families of cyclopeptides synthesized by two independent non-ribosomal peptide synthetases encoded in tandem within the same biosynthetic gene cluster (cpp). The cluster lacks a thiosterase domain to release and cyclize the pentapeptides; however, it contains a stand-alone PBP-type protein with a betalactamase conserved domain (CppA) upstream the first NRPS gene. The heterologous expression of the cpp cluster in the host Streptomyces albidoflavus J1074 confirmed its implication in the biosynthesis of both pentaminomycins and BE-18257 antibiotics, while the generation of a knockout by genetic replacement of cppA demonstrated the involvement of this protein in the release and cyclization of the peptide chains of both cyclopeptide families. Cacaoidin is a novel glycosylated lanthipeptide with remarkable unprecedented structural features, such as an unusually high number of D-amino acids, an N,N-dimethyl lanthionine system (NMe2Lan), not previously found in known lanthipeptides, and an O-glycosylated Tyr residue with a not previously reported disaccharide formed by α-L-rhamnose and β-L-6-deoxygulose. The available predictive tools were not able to detect the biosynthetic gene cluster responsible of the production of cacaoidin, which was found using the C-terminal amino acid sequence of the structural peptide. The final cao cluster was determided after BLAST analysis and HHpred secondary structure prediction. The heterologous expression of the cluster in S. albidoflavus J1074 confirmed the involvement of the cluster in the biosynthesis of cacaoidin and led to the identification of a new variant of cacaoidin with a different disaccharide lacking two oxygen atoms (cacaoidin-2O). The generation of knockout strains in the heterologous host by genetic replacement allowed the assignment of different roles in several genes in the biosynthesis of cacaoidin: cao4 is involved in the N,N-dimethylation of the N-terminal Ala residue and cao8 and cao16 are two glycosyltransferases working cooperatively in the Tyr O-glycosylation. The generation of the aglycon of cacaoidin was achieved by the controlled acid hydrolysis of pure cacaoidin-2O.
