Intratumoral pharmacokinetics: development of methodologies to study drug penetration and distribution in vitro and in vivo models

• Autores: Maria Jové Casulleras
• Directores de la Tesis: Ramón Salazar Soler (dir. tes.), Chris Twelves (codir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2021
• Idioma: inglés
• Tribunal Calificador de la Tesis: Emiliano Calvo Aller (presid.), Helena Colom Codina (secret.), George Pentheroudakis (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Medicina e Investigación Traslacional por la Universidad de Barcelona
• Materias:
  • Ciencias médicas
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• Resumen

  • 1. INTRODUCCIÓN Para que los tratamientos contra el cáncer sean efectivos, los fármacos han de poder llegar a las células tumorales a una determinada concentración que sea eficaz y distribuirse de forma homogénea en el tumor. La limitación de los fármacos antineoplásicos para poder llegar y distribuirse de forma adecuada en el tumor es conocida como resistencia farmacocinética (Minchinton A et al. Nat.Rev.Cancer 2006).

    Los tumores tienen una complicada y aberrante vasculatura, un pobre sistema linfático, células neoplásicas compactas y con zonas de necrosis y un estroma rico en fibroblastos disfuncionales que dificultan una buena penetrancia y distribución de los fármacos a nivel intratumoral (Minchinton et al. Nat.Rev.Cancer 2006; Tannock I et al. Clin Cancer Res 2002). Además, las propiedades fisicoquímicas de los medicamentos influyen en la liberación de los tratamientos en su sitio diana (Nerini F, Clin Pharmacol 2014).

    En el proceso de desarrollo de nuevos fármacos, los estudios preclínicos de penetración del fármaco no acostumbran a ir más allá de estudios in vitro con células intestinales tipo Caco-2 como modelo de absorción del fármaco en el tubo digestivo 8. Estudios sobre la farmacocinética intratumoral son muchas veces escasos o nulos. Algunos modelos multicelulares, como los cultivos celulares multicapa o los esferoides se han utilizado para estudiar la penetrancia intratumoral de los fármacos anticancerígenos (Huan et al. J Control Release 2018; Altrock P et al Nat Rev Cancer 2015) e incluso se han podido derivar modelos biomatemáticos (Evans C et al. Cancer Cell Int 2015; Groch CM t al JRSOc Interface 2014). A estos modelos, sin embargo, les faltan parámetros importantes como la vascularización del tumor o el efecto del estroma.

    El estudio de la farmacocinética intratumoral es y ha sido siempre compleja. En el desarrollo de nuevos tratamientos, los estudios de farmacocinética son una rutina habitual y muy importante pero raramente van más allá del estudio de la farmacocinética plasmática. Una excepción es la capecitabina, un profármaco clásico del 5FU, donde en un estudio con muestras tumorales de pacientes confirmó una mayor conversión de capecitabina a 5FU en el tumor (Schüller J et al Cancer Chemother Pharmacol 2000).

    Habitualmente los estudios farmacocinéticos intratumorales están basados en medida de la “cantidad" de fármaco que llega en global del tumor, es decir, miden la concentración del fármaco y/o sus metabolitos en el tejido, habitualmente por LC/MS/MS. Este proceso, implica la homogeneización de la muestra con la consecuente pérdida de la estructura del tejido. Recientemente, técnicas como el MALDI-MS han conseguido procesar imágenes de la distribución de fármacos en el tejido con una resolución de hasta 20-30μm permitiendo el análisis de la distribución del fármaco en el tumor (Schöne C et al. Clin Biochem 2013; Morosi L et al. Curr Opin. Pharmacol 2013).

    En esta tesis presento los resultados de un estudio de farmacocinética intratumoral de palbociclib y 5FU, dos fármacos con propiedades fisicoquímicas opuestas, mediante dos modelos in vitro de penetración y eflujo de los fármacos: células en suspensión en el medio y esferoides (modelo tridimensional). Palbociclib es un inhibidor de CDK4/6 con indicación para cáncer de mama con receptores hormonales positivos (EMA palbociclib;FDA Palbociclib) muy lipofílico y con un alto volumen de distribución (Drugbank Palbociclib) indicando una alta unión a tejidos, mientras que 5FU es un quimioterápico clásico usado en muchos esquemas de quimioterapia altamente hidrofílico y con un volumen de distribución bajo (Drugbank 5FU) y poca unión a tejidos. Por otro lado, el modelo de células en suspensión representa células libremente flotando en el medio mientras que el modelo de pequeña porción de tejido tumoral con células juntas y compactas en forma de esfera.

    En un segundo bloque, he realizado un estudio farmacocinético in vivo en xenografts de cáncer de mama donde los animales recibían o no una dosis puntual de eribulina endovenosa 8 días previos a una dosis de capecitabina. La eribulina es un quimioterápico de la familia de los antimicrotúbulos (Kistenov G et al. Cancer Res 2004) pero que también tiene otras propiedades, entre ellas un efecto remodelador de la vasculatura tumoral. Estudios previos in vivo han demostrado este efecto de mejoría de la vascularización intratumoral aparece entre los 6-10 días de la administración de eribulina y que su administración previa a capecitabina aumenta la eficacia respeto a capecitabina sola (Funahashi Y et al. Cancer Sci 2015). No se ha comprobado si esta mejoría se debe simplemente a una adición de los efectos citostáticos de los dos fármacos o bien si los efectos de remodelación de la vasculatura tumoral por la administración de eribulina previa implica una mejoría de la farmacocinética intratumoral de la capecitabina, permitiendo una mayor penetrancia y distribución de la misma dentro del tumor.

    2. HIPÓTESIS Y OBJECTIVOS 2.1. HIPÓTESIS: - La utilización de LC/MS/MS es factible para medir la concentración de fármacos y sus metabolitos en modelos de farmacocinética celulares y en esferoides.

    - Los modelos farmacocinéticos in vitro pueden ser útiles para estudiar como las diferentes propiedades fisicoquímicas de los fármacos influyen en su penetración y distribución intratumoral.

    - Los modelos farmacocinéticos in vitro pueden modelar el movimiento de un fármaco dentro del tumor y propiciar el desarrollo de modelos biomatemáticos.

    - Estudios farmacocinéticos in vivo que combinan LC/MS/MS y MALDI-MSI pueden ser útiles para ver si la eribulina mejora la captación intratumoral de capecitabina.

    2.2. OBJECTIVOS: - Desarrollar una metodología para estudiar la farmacocinética intratumoral de palbociclib y 5FU in vitro en células en suspensión y en modelos tridimensionales (esferoides).

    - Estudiar si hay diferencias en la captación de fármacos entre los modelos de células en suspensión en el medio versus el modelo de esferoides.

    - Investigar cómo las diferentes propiedades fisicoquímicas de 5FU y palbociclib afectan en la farmacocinética intratumoral y cómo pueden usar estos datos para desarrollar modelos biomatemáticos.

    - Desarrollar un método altamente sensible para medir la concentración de capecitabina, 5DFCR, 5DFUR, 5FU, 5FdUrd, 5FUrd in vivo.

    - Explorar si la administración previa de eribulina al tratamiento de capecitabina mejora la captación intratumoral de capecitabina y sus metabolitos mediante una mayor penetración de capecitabina i/o mejorando su distribución en el tumor.

    3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. Resumen de resultados y discusión de los modelos in vitro de farmacocinética intratumoral de palbociclib y 5FU Se han realizado estudios de penetración y eflujo de palbociclib y 5FU tanto en células en suspensión en el medio cómo en esferoides. Para los experimentos se han utilitzado dos líneas celulares, una de cáncer de mama (MCF-7) y una de cáncer colorectal (DLD-1). Los resultados obtenidos demuestran que palbociclib tiene una importante captación del fármaco intracelular con unas Cmax que llegan hasta 32 veces mayores, respecto la concentración de palbociclib en el medio (concentración tratante). En cambio, 5FU presenta una Cmax intracelular de aproximadamente la mitad respecto a la concentración tratante de 5FU en el medio. Estas observaciones se replican tanto en modelos de células en suspensión como en los esferoides y en las diferentes dosis usadas.

    En palbociclib, la penetración intracelular del fármaco es rápida llegando a una Cmax en el modelo de células en suspensión en los primeros 10 minutos (Tmax), mientras que para el modelo de esferoides la Tmax es de unas dos horas. En cambio, el eflujo es lento en los dos modelos (células en suspensión y esferoides) llegando al equilibrio entre concentraciones intracelulares y extracelulares entre 4-8h. Hemos encontrado diferencias entre las dos líneas celulares siendo mayor la cantidad de captación de palbociclib intracelular en MCF-7 respecto DLD-1 (Cmax unas tres veces mayor), en cambio, en los experimentos de eflujo de palbociclib la línea celular de DLD-1 llega antes al equilibrio entre la concentración intracelular y extracelular. En 5FU no hemos encontrado diferencias entre los experimentos hechos en las dos líneas celulares. La captación y eflujo de 5FU es rápida tanto en células en suspensión como en esferoides sin encontrar diferencias entre los dos modelos y llegando a que el equilibrio en los experimentos de eflujo se establece a los 10 minutos.

    Estas diferencias entre los dos fármacos se pueden explicar en parte debido a las características fisicoquímicas opuestas que presentan. Una alta unión intracelular de palbociclib explicaría su alta concentración intracelular en Cmax (32 veces más que la concentración extracelular). Palbociclib es un fármaco muy lipofílico que traviesa la membrana de forma rápida y una vez en el espacio intracelular queda secuestrado en los lisosomas, tal y como ha demostrado un estudio in vitro (Llanos et al. Oncogene 2019). Probablemente hasta que no hay una saturación de la unión intracelular de palbociclib, no se consigue llegar a un equilibrio entre la concentración de palbociclib libre en el medio (extracelular) y la concentración de palbociclib libre intracelular. Por otro lado, el eflujo es lento hecho que se puede explicar por la liberación lenta de pabociclib unido a los componentes intracelulares. Es decir, cuando las células dejan de estar expuestas al tratamiento con palbociclib, empieza el eflujo del palbociclib libre en el citosol hacia el medio extracelular sin fármaco, desequilibrando la diferencia entre palbocilib intracelular libre y unido. Una liberación lenta de la gran cantidad de palbociclib unido a los componentes celulares podría ser la causa de este lento eflujo de palbociclib. Esta hipótesis va en consonancia con los resultados del estudio de Llanos et al. donde se comprobó que palbociclib queda unido en los lisosomes intracelulares y que las células son capaces de seguir liberando palbociclib en el medio extracelular tiempo después de la retirada del fármaco. En cambio, 5FU tiene una unión intracelular baja permitiendo un equilibrio intra/extracelular del fármaco rápida.

    Las diferencias en los experimentos con pabociclib entre el modelo de células en suspensión y esferoides se podría explicar otra vez por esta alta unión intracelular del fármaco, pues en esferoides, sólo cuando se consigue el equilibrio entre las concentraciones de palbociclib libre intracelular y el medio en la primera capa de células, el fármaco es capaz de penetrar en la siguiente. Este efecto se ha visto con doxorrubicina 9,73, otro fármaco con características fisicoquímicas similares a palbociclib con un alto volumen de distribución y secuestro intracelular en este caso en el núcleo de las células (Coley H et al. Br J Cancer 1993). En cambio, 5FU es un fármaco hidrosoluble con una baja unión a nivel intracelular y una rápida penetrancia a través de la membrana celular tanto por difusión como por sus proteínas transportadoras (Drugbank 5FU; Wohlhueter et al J Cell Physiol 1980). El fármaco, por lo tanto, no queda “secuestrado” dentro de la célula y es libre de moverse entre las diferentes capas de los esferoides, hecho que explicaría porque no encontramos diferencias entre los dos modeles utilizados in vivo. La rápida penetración de 5FU en esferoides ya se había objetivado en estudios previos (Nederman et al. Cancer Chemother Pharmacol 1984). La captación intracelular de 5FU es más lenta que el eflujo. Esto podría explicarse por una rápida metabolización de 5FU una vez entra en el espacio intracelular. Esta hipótesis se sostiene en el hecho que en los estudios de penetración de 5FU con una concentración alta en el medio tratante (100 μM) observamos metabolitos de 5FU en los primeros minutos. No es hasta que se satura el proceso de conversión de 5FU a sus metabolitos que no se llega a una concentración estable intracelular.

    Las diferencias observadas en la captación de palbociclib entre las diferentes líneas celulares no quedan del todo claras. Una posible hipótesis seria que las dos líneas celulares tienen una expresión diferente de transportadores de eflujo de fármacos. De hecho, tanto las líneas celulares MCF-7 como DLDL-1 expresan PgP y BCRP, dos conocidas proteínas transportadoras de efflujo de palbociclib (De Gooijer M Invest New Drugs 2015; Parrish K et al. J Pharmacol Exo Ther 2015). Una mayor sensibilidad a palbociclib en una de las dos líneas celulares podría también tener implicaciones en una mayor captación del propio fármaco. Palbociclib induce la senescencia (VanArsdale T et al. Cl,in Cancer Res 2015; Valenzuela CA et al Exp Cell Res 2017). Se ha observado que las células senescentes tienen un mayor componente lisosomal y acumulación del fàrmac (Llanos et el Oncogene 2019). No hemos hecho estudios de expresión proteica entre las dos líneas celulares ni tampoco de sensibilidad al fármaco. Estas son posibles áreas de investigación futura.

    Finalmente, en colaboración con el grupo de investigación del Prof. Mathew Hubbard de la Universidad de matemáticas de Nottingham se realizó un modelo biomatemático de la farmacocinética intracelular de palbociclib. El modelo es capaz de representar la mayor parte de los resultados observados en los experimentos exceptuando la rápida penetración inicial de palbociclib. El modelo da soporte a una importante y rápida unión intracelular de palbociclib y una posterior lenta liberación.

    3.2. Resumen de resultados y discusión del estudio de farmacocinética in vivo de capecitabina cuando se añade dosi única previa de eribulina Para este estudio usamos ratones xenografts de cáncer de mama con dos tumores por flanco. Los xenografts se dividieron en dos ramas de tratamiento en función de si recibieron o no una única dosis de eribulina 8 días previos a una dosis puntual de capecitabina oral. Los animales fueron sacrificadps post-dosis de capecitabina a los 15 minutos, 30 minutos, 1h, 2h, 4h, 6h y 24h. Se recolectaron muestras de plasma, piel, músculo y tumor para el análisis farmacocinético. Por cada tiempo de colección de muestras se usaron tres xenografts por rama de tratamiento.

    No encontramos diferencias entre las concentraciones intratumorales de capecitabina o sus metabolitos entre las dos ramas de tratamiento. Tampoco encontramos diferencias en las concentraciones de capecitabina o sus metabolitos en los tejidos sanos ni plasmáticas. La única excepción fueros los niveles de capecitabina plasmática en el grupo de combinación significativamente más bajas que en el grupo control por un error técnico. No se encontraron diferencias entre las dos ramas entre las concentraciones plasmáticas de todos los otros metabolitos ni tampoco en las concentraciones de capecitabina en el tumor o tejidos sanos.

    Sí que se encontraron diferencias en las concentraciones de los diferentes metabolitos de capecitabina en función del tejido analizado, siendo mayores las concentraciones de 5FU y 5DFUR en el tumor respecto los tejidos sanos (piel y músculo), mientras que 5DFCR es claramente superior en tejidos sanos, confirmando la preferente activación de capecitabina en el tumor. El estudio corrobora y reproduce los resultados de estudios previos, dándole validez externa. Estudios previos de farmacocinética intratumoral de capecitabina, tanto en xenografts como en muestras de pacientes se observaros la preferente activación de capecitabina en el tumor con mayores niveles de 5FU intratumoral respecto a los tejidos sanos (Schüller J et al Cancer Chemother Pharmacol 2000; Ishikawa T et al. Biochem Pharmacol 1998). Además, les curvas de farmacocinética son similares a las descritas previamente en estos estudios.

    Se optimizó la técnica de MALDI-MSI para estudiar la distribución de capecitabina en el tumor. Sólo fuimos capaces de procesar imágenes para la rama control objetivando una homogénea distribución de capecitabina en el tumor y una diferente localitzación de sus metabolitos, expresando probablemente diferentes estados del metabolismo en el tumor. Las muestras de tumors pretratados con eribulina presentavan altos niveles de necrosis y ruptura debido al procesamiento de las muestras haciendo imposible realizar MALDI-MSI. Esta es una limitación mayor del estudio.

    Eribulina es un remodelador vascular (Funahashi Y et al Cancer Sci 2014; Ito K et al Cancer Sci 2017). En un estudio previo se observó como la administración de eribulina previa a paclitaxel mejoraba la eficacia del tratamiento, pero no si el orden de administración era a la inversa (Ito K et al Cancer Sci 2017). En este mismo estudio, el pretratamiento de eribulina y no de vinorelbina mejorava la efectivitat de doxorrubicina liposomal. No se realizaron estudios de distribución de los fármacos intratumorals. Eribulina, vinorelbina y paclitaxel son inhibidors de microtúbulos, pero con mecanismo de acción diferente, hecho que puede explicar las diferencias encontradas. Otros fármacos con propiedades de remodelación vascular como el bevacizumab sí que ha demostrado una mejoria en eficacia en combinación con paclitaxel gracias a una más homogénea distribución de paclitaxel en el tumor (Cesca M et al, Mol Cancer Ther 2016).

    Nuestro estudio no es capaz de responder si eribulina mejora la distribución de capecitabina en el tumor por las limitaciones técnicas. El hecho que la distribución de capecitabina sea homogénea en el tumor en la rama control hace difícil pensar que el efecto de la eribulina como a remodelador vascular influya de forma significativa en la efectividad de la combinación. La importante necrosis observada en los tumores pretratados con eribulina indica que probablemente sea el efecto citostático el que tenga mayor relevancia.

    4. CONCLUSIONES - Los resultados demuestran la importancia de las propiedades fisicoquímicas de los fármacos en la penetración y distribución de los mismos a nivel celular y intratumoral.

    - La comparación entre 5FU y palbociclib demuestra la importancia de conocer las propiedades fisicoquímicas de los fármacos que usamos en nuestros pacientes pata entender y mejorar los esquemas de tratamiento.

    - El dato más relevante de los estudios in vitro de palbociclib es su elevada concentración intracelular y su rápida acumulación tras la exposición del fármaco. La actividad de los fármacos in vitro se acostumbra a medir con IC50, concentración de fármaco en el medio tratante (extracelular) en el que conseguimos un 50% de su efecto. Pero, si la concentración intracelular del fármaco varía mucho respecto al del medio, podría dar lugar al uso de dosis subóptimas en el desarrollo de fármacos.

    - Los resultados obtenidos en el modelo matemático de palbociclib dan soporte a las hipótesis derivadas de los experimentos.

    - Anticipamos que, a pesar de la limitación de la sencillez del modelo matemático, este podría ayudar a entender los mecanismos que explican la farmacocinética intratumoral de los fármacos y posiblemente a poder extrapolar los datos de farmacocinética de plasma a tumor.

    - El modelo matemático podría ser potencialmente aplicable a otros fármacos.

    - El pretratamiento con eribulina no aumenta la concentración de capecitabina o sus metabolitos a nivel intratumoral.

    - No hemos podido discernir si eribulina mejora la distribución intratumoral de capecitabina o sus metabolitos.

    - MALDI-MSI es una técnica útil para estudiar la distribución de los fármacos a nivel intratumoral pero difícil de aplicar, sobretodo en tumores pretratados con quimioterapia dado a que si edfecto citotóxico provoca cambios en la estructura que dificulta el su análisis.

    - El estudio in vivo confirma la preferente activación de capecitabina a 5FU en el tumor.