Tinkering with carbohydrate-active enzymes for novel specificities: chitin deacetylases and glycosidases
- Autores: Sergi Pascual Torrent
- Directores de la Tesis: Antonio Planas Sauter (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Ramon Llull ( España ) en 2022
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Pere Clapés Saborit (presid.), Benjamí Oller Salvia (secret.), Tom Desmet (voc.), Regis Fauré (voc.), Ramón Hurtado Guerrero (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Bioingeniería por la Universidad Ramón Llull
- Materias:
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- Resumen
Esta tesis se divide en dos temas en función de las enzimas estudiadas: quitina desacetilasas y glicosidasas. En ambos casos, el objetivo es modificar la especificidad por sustrato para diseñar nuevos biocatalizadores.
Las quitinas desacetilasas actúan sobre la quitina para obtener el quitosano. Los quitosanos son una familia de polisacáridos compuestos de N-acetil-glucosamina y glucosamina. Los oligosacáridos de quitosano han demostrado ser moléculas bioactivas con una gran variedad de aplicaciones en los campos de la biotecnología y la biomedicina. Con el objetivo de superar los problemas de la desacetilación química de la quitina para la obtención del quitosano se utilizó la alta selectividad en términos de preferencia por sustrato y rendimientos de producto de las reacciones enzimáticas. La resolución de la estructura 3D de la quitina desacetilasa de Vibrio cholera en complejo con distintos sustratos fue un hito clave en el establecimiento del modelo Subsite Capping Model para racionalizar los patrones de desacetilación específicos de esta familia de enzimas.
Con ello, el objetivo principal del primer tema de la tesis consiste en la evaluación de las relaciones estructura-función con el objetivo de apoyar la hipótesis del Subsite Capping Model y modificar la especificidad por sustrato de la quitina deacetilasa de Vibrio cholera hacia nuevos biocatalizadores. Después de diseñar un ensayo de cribado de alto rendimiento que permite determinar la actividad desacetilasa en quitooligosacáridos, se prepararon una serie de mutantes que implicaban desde el loop 5 a los subsitios positivos que rodean el centro activo de la enzima basados tanto en un diseño racional así como en la evolución dirigida. Los experimentos estructurales y cinéticos de los mutantes diseñados permitieron concluir que la modificación de la dinámica de los loops afecta no sólo a la especificidad del sustrato, sino también al mecanismo de unión, cambiando el mecanismo de selección conformacional de la enzima wt a un mecanismo de el ajuste inducido permitiendo así dilucidar los determinantes moleculares que definen la especificidad por sustrato.
El segundo tema de la tesis trata sobre la ingeniería de la familia de las glucosidasas para estudiar y modificar las interacciones enzima-sustrato con una potencial clase de sustratos, los septanósidos, anillos de siete miembros, no naturales que son homólogos en el anillo de piranosa. El objetivo es rediseñar una glucosidasa para aceptar septanósidos con el fin de convertirse en un nuevo sistema biortogonal con diversas aplicaciones en el campo de la biotecnología. En la presente tesis se logró la síntesis de septanósidos cromogénicos como sustratos potenciales para el cribado de un panel de glicosidasas. Se identificó la beta-glucosidasa de Streptomyces sp. como principal candidato potencial para la ingeniería de la actividad hidrolasa. Los estudios preliminares de mutagénesis identificaron una serie de residuos del centro activo como candidatos para la preparación de bibliotecas combinatorias para diseñar la especificidad de la enzima. Asimismo, experimentos in silico establecieron una premisa para nuevas configuraciones de septánosidos para aumentar el panel de sustratos disponibles para mayores estrategias de evolución dirigida.
