Caracterización morfológica, genética y fisiológica de cianobacterias dominantes en sistemas fluviales

• Autores: Esther Berrendero Gómez
• Directores de la Tesis: Pilar Mateo (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2008
• Idioma: español
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• Resumen

  • ÍNDICE INTRODUCCIÓN .............................................................................. 1 I. CIANOBACTERIAS. CARACTERÍSTICAS GENERALES ......................... 1 I.1. Ecologia. Distribución de las cianobacterias ............................... 2 I.2. Organización celular. .............................................................. 4 I.2.1. Células vegetativas .............................................................. 4 I.2.2. Células especializadas ....................................................... 6 II. DIVERSIDAD MORFOLÓGICA. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA .... 7 II.1. Orden Oscillatoriales. Subsección III ........................................ 13 II.1.1. Clasificación taxonómica ................................................. 15 II.2. Orden Nostocales. Subsección IV. ............................................ 17 II.2.1. Clasificación taxonómica ............................................. 18 II.2.2. Género Nostoc. .............................................................. 21 II.2.3. Género Calothrix .............................................................. 21 II.2.4. Género Rivularia ............................................................. 22 II.2.5. Género Tolypothrix ........................................................... 22 III. DIVERSIDAD GENÉTICA. INCORPORACIÓN DE MÉTODOS MOLECULARES EN LA IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE CIANOBACTERIAS. ................................................................. 23 III. 1. Métodos moleculares empleados para la caracterización de cianobacterias. ............................................................................ 24 III.1.1. Operon de la ficocianina (cpcBA-IGS). .............................. 25 III.1.2. Subunidad del ARN ribosómico 16S (ARNr 16S). ...................... 27 III.1.3. Técnicas de perfiles genéticos o finger printing. ......... 28 IV. DIVERSIDAD FISIOLÓGICA .................................. 30 IV.1. Metabolismo de las cianobacterias ................................... 30 IV.1.1. Actividad fosfatasa ................................................... 31 IV.1.1.1. Enzimas fosfatasas. Localización. ......................... 34 IV.1.1.2. Factores que influyen en la síntesis y degradación de la enzima fosfatasa. ................................................................................ 35 IV.1.1.3. Factores ambientales que regulan la actividad fosfatasa. ........ 37 IV.1.1.4. Medida de la actividad fosfatasa. ......................... 39 ii IV.1.1.5. Ventajas adaptativas relacionadas con el metabolismo del P y la actividad fosfatasa. ..................................................................... 40 Formación del pelo ..................................................................... 40 Polifosfatos ............................................................................... 41 IV.1.2. Fijación de N2 ............................................................... 42 IV.1.2.1. Estructura del complejo enzimatico nitrogenasa................ 43 IV.1.2.2. Estrategias adoptadas por los diferentes organismos para la fijación del nitrógeno. ................................................................ 44 IV.1.2.3. Mecanismo de fijación del nitrógeno y asimilación. ................. 46 ANTECEDENTES Y OBJETIVOS DEL TRABAJO ................................... 48 DESCRIPCIÓN DEL MEDIO ............................................................. 50 I. Río Alberche. ........................................................ 51 II. Río Alhárabe. ......................................................................... 52 III. Río Amir. ............................................................................... 53 IV. Río Blanco. ............................................................................... 54 V. Río Endrinales. .................................................................... 55 VI. Río Guadarrama. ................................................................. 55 VII. Río Matarraña. ................................................... 57 VIII. Arroyo Mediano ............................................................. 58 IX. Arroyo Tejada Y Arroyo Cereal ........................................................ 59 X. Arroyo Red ................................................................................ 60 XI. Río Muga. .............................................................................. 61 XI.1. Descripción del punto de muestreo ............................. 62 XI.2. Características fisico-químicas del agua .......................... 66 MATERIALES Y MÉTODOS ............................................... 70 I. MATERIAL BIOLÓGICO. .............................. 70 II. TÉCNICAS DE CULTIVO DE CIANOBACTERIAS. ................. 72 II.1. Medios de cultivo ............................................ 72 II.2. Condiciones de cultivo y siembra ................................ 73 III. TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE CIANOBACTERIAS...................... 74 III.1. Aislamientos de cianobacterias del epiliton ........... 74 III.2. Aislamientos de cepas a partir de colonias de Rivularia ........ 75 IV.TÉCNICAS UTILIZADAS PARA LA CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE CIANOBACTERIAS. ................................................. 76 iii V. TÉCNICAS EMPLEADAS EN LA CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE CIANOBACTERIAS ..................................................................... 77 V.1. Extracción de ADN genómico de cianobacterias ......... 77 V.2. Determinación de la región intergénica del operón de la ficocianina mediante PCR .................................................... 78 V.2.1. Amplificación de la región cpcBA-IGS .......................... 78 V.2.2. Clonación de los fragmentos amplificados de la región cpcBA-IGS ....................................................................................... 80 Medios de cultivo empelados para E. coli. ........................................ 80 Preparación de bacterias competentes. .............................................. 81 Transformación ................................................................................. 81 V.2.3. Aislamiento de ADN plasmídico y análisis de restricción. ........... 82 V.2.4. Secuenciación. ................................................................... 83 V.3 Estudio de la región cpcBA-IGS mediante polimorfismo de los fragmentos de restricción del ADN (RFLPs) .................................... 84 V.4 Análisis de la región cpcBA-IGS por medio de electroforesis en geles desnaturalizantes por gradiente térmico (TGGE) .................................. 84 V.4.1 Amplificación de la región intergénica cpcBA-IGS. ...................... 84 V.4.2 Utilización de TGGE con los amplicones de cpcBA-IGS . ............ 84 V.4.3. Recuperación de los alelos de los geles de poliacrilamida. ......... 86 V.5. Determinación del gen ARNr 16S en cianobacterias mediante PCR . 86 V.5.1. Amplificación del gen que codifica para el ARNr 16S. ................ 87 V.5.2. Clonación de los fragmentos amplificados del gen ARNr 16S. .... 88 V.6. Estudios de biodiversidad de cianobacterias mediante el análisis del ADNr 16S empleando TGGE ......................................................... 89 V.6.1. Amplificación del gen que codifica para el 16S rRNA ................. 89 V.6.2. Utilización de TGGE en la separación de los amplicones del gen 16S rRNA. ......................................................................................... 89 V.6.3. Recuperación de los alelos de los geles de poliacrilamida. ........ 90 V.7. Procesamiento y análisis filogenético de las secuencias obtenidas .. 90 VI.TÉCNICAS EMPLEADAS PARA LA EXPERIMENTACIÓN FISIOLÓGICA in situ .................................................... 91 VI.1. Río seleccionado para los ensayos in situ ............................. 91 VI.1.1. Determinaciones fisico-químicas del agua. ........ 92 VI.1.2. Recogia de muestras. .................................................. 92 iv VI.2. Ensayos de actividad fosfatasa ...................................... 95 VI.2.1 Preparación de las muestras biológicas y del material. ......... 95 VI.2.2. Preparación de los reactivos químicos. .......................... 95 Sustratos. .................................................. 95 Solución de parada. ................................................... 96 VI.2.3. Medio de ensayo...................................................................96 VI.2.4. Determinación de la actividad fosfatasa. ....................... 97 VI.2.5. Ensayos de actividad fosfatasa. ........................................ 97 VI.2.6. Determinación del contenido en clorofilas a. ...................... 99 VI.2.7. Ensayos de actividad fosfatasa realizados en el laboratorio ......... 99 Test de temperatura. ........................................................................ 100 Ensayos de actividad fosfatasa a lo largo del tiempo. ..................... 100 Ensayos de luz vs oscuridad. ........................................................... 100 Cinética enzimática. ........................................................................ 100 Ensayos de actividad fosfatasa extracelular. ................................... 101 VI.3. Determinación de la fijación de N2. ...................................................... 101 VI.3.1. Método experimental. ................................................................. 101 VI.3.2. Análisis cromatográfico de las muestras. ...................... 102 VI.3.3. Tipos de ensayos de fijación de N2 realizados................... 103 VI.4. Análisis estadístico de los datos obtenidos............................... 103 RESULTADOS ............................................................................ 104 I. CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE LAS CIANOBACTERIA.104 I.1. Caracterización de cianobacterias con tricomas atenuados: morfotipos Rivularia, Calothrix y Tolypothrix. .......................................... 104 I.1.1. Caracterización de muestras de campo. ......................................... 104 I.1.1.1. Análisis macroscópico y microscópico de muestras naturales de Rivularia. ................................................................................ 104 I.1.1.2. Análisis microscópico de muestras naturales de Calothrix. ...... 109 I.1.1.3. Análisis macroscópico y microscópico de muestras naturales de Tolypothrix. ................................................................................ 109 I.1.2. Caracterización de cepas aisladas. .......................................... 111 I.1.2.1. Cianobacterias con tricomas atenuados aisladas de ríos calizos con dominancia de Rivularia ............................... 111 I.1.2.1.1. Cianobacterias tipo Rivulariaceae. ...................... 111 I.1.2.1.2. Cianobacterias tipo Tolypothrix. .................................. 114 v I.1.2.2. Cianobacterias con tricomas atenuados aisladas de ríos silíceos o calizos sin Rivularia ........................................................................ 115 I.1.3. Influencia del medio de cultivo en el crecimiento y características morfológicas de las cianobacterias. ................................................. 122 I.2. Caracterización de muestras de campo de Nostoc. ............................... 126 I.3. Caracterización de tapetes microbianos. ................................................ 127 II. CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE LAS CIANOBACTERIAS Y ANÁLISIS FILOGENÉTICO. ....................................................................... 130 II.1. Caracterización genética de cianobacterias con tricomas atenuados: morfotipos Rivularia, Calothrix y Tolypothrix. ...................................... 130 II.1.1. Empleo de la secuencia cpcBA-IGS en la caracterización de muestras naturales de Rivularia y cepas aisladas tipo Rivulariaceae de ríos calizos con dominancia de Rivularia ........................................ 130 II.1.1.1. Análisis de la secuencia cpcBA-IGS por PCR y posterior secuenciación. .................................................................................. 130 II.1.1.2. Análisis de la secuencia cpcBA-IGS amplificada mediante RFLP ......................................................................................................... 133 II.1.1.3. Análisis mediante TGGE de la región cpcBA-IGS amplificada. ......................................................................................................... 135 II.1.1.4. Análisis filogenético de las secuencias obtenidas. .................... 136 II.1.2. Empleo de los genes que codifican para el ARNr 16S en la caracterización de muestras naturales de Rivularia y cepas aisladas tipo Rivulariaceae de ríos calizos con dominancia de Rivularia ..... 140 II.1.2.1. Análisis de la secuencia de ADNr 16S por PCR y posterior secuenciación. .................................................................................. 140 II.1.2.2. Análisis filogenético de las secuencias obtenidas. .................... 142 II.1.3. Empleo de la secuencia cpcBA-IGS en la caracterización de Calothrix y Tolypothrix ................................................................... 144 II.1.3.1. Análisis de la secuencia cpcBA-IGS por PCR y posterior secuenciación. .................................................................................. 144 II.1.3.2. Análisis mediante TGGE de la región cpcBA-IGS amplificada. ......................................................................................................... 146 II.1.3.3. Análisis filogenético de las secuencias obtenidas. .................... 149 II.1.4. Empleo de los genes que codifican para el ARNr 16S en la caracterización de Calothrix y Tolypothrix ..................................... 152 vi II.2. Caracterización genética de cianobacterias pertenecientes al género Nostoc. ....................................................................................................... 154 II.2.1. Empleo de la secuencia cpcBA-IGS en la identificación de muestras naturales de Nostoc .......................................................................... 154 II.2.2. Empleo del gen ARNr 16S en la identificación de muestras naturales de Nostoc .......................................................................... 158 II.3. Caracterización genética de tapetes microbianos ................................ 161 II.3.1. Empleo de la secuencia cpcBA-IGS en la caracterización de diferentes tapetes microbianos ........................................................ 161 II.3.2. Empleo del gen ARNr 16S en la caracterización de de diferentes tapetes microbianos ......................................................................... 164 III. ESTUDIO FISIOLÓGICO DE LAS CIANOBACTERIAS DOMINANTES EN EL RÍO MUGA ............................................................. 167 III.1. Estudio de la actividad fosfatasa en cianobacterias dominantes del río Muga .......................................................................................................... 167 III.1.1. Evolución de la actividad fosfatasa a lo largo del tiempo .......... 167 III.1.2. Estudio de la actividad fosfatasa in situ ...................................... 169 III.1.3. Respuesta de la actividad fosfatasa ante diferentes concentraciones de sustrato: Cinética enzimática ...................................................... 171 III.1.4. Determinación de la actividad fosfatasa extracelular ................. 175 III.1.5. Efecto de la luz vs oscuridad en la actividad fosfatasa ............... 175 III.1.6. Influencia de la temperatura en la actividad fosfatasa ................ 176 III.2. Estudio de la capacidad de fijación de N2 de las cianobacterias dominantes del río Muga ......................................................................... 178 DISCUSIÓN ............................................................................................................. 182 I. Análisis de muestras naturales de Rivularia y aislados tipo Rivulariaceae de diferentes ríos calizos con dominancia de Rivularia. .................................... 183 II. Análisis de cianobacterias pertenecientes a los géneros Calothrix y Tolypothrix. ....................................................................................................... 191 III. Análisis de muestras naturales y aislados de Nostoc................................ 197 IV. Análisis de tapetes microbianos del río Muga. ......................................... 202 V. Estudio de la actividad fosfatasa y nitrogenásica en las cianobacterias dominantes del río Muga. ................................................................................ 206 CONCLUSIONES .................................................................................................... 214 BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 216 ANEXO ......................................................................................................................... I