Nous mecanismes de control en l’homeòstasi dels dntps mitocondrials: paper de la proteïna NDUFA10 en la disponibilitat del dgtp
- Autores: David Molina Granada
- Directores de la Tesis: Ramón Martí Seves (dir. tes.), Yolanda Cámara Navarro (codir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2021
- Idioma: catalán
- Tribunal Calificador de la Tesis: Maria Solà Vilarrubias (presid.), Miquel Vila Bover (secret.), Ester Ballana Guix (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Bioquímica, Biología Molecular y Biomedicina por la Universidad Autónoma de Barcelona
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TDX
- Resumen
Las mitocondrias necesitan mantener un contenido en dNTPs adecuado para garantizar los procesos de replicación y reparación del DNA mitocondrial (mtDNA). Para asegurar la disponibilidad de estos dNTPs, las células eucariotas disponen de dos vías anabólicas diferenciadas: la síntesis de novo y la ruta de salvamento de dNTPs. Las mutaciones en genes nucleares que se traducen en una perturbación de la homeostasis de dNTPs se asocian a defectos en el mantenimiento del mtDNA, dando lugar a alteraciones en su cantidad y calidad.
Tradicionalmente se ha adoptado la idea de que los dNTPs se encuentran en proporciones similares, y principalmente solubilizados de forma libre en la matriz mitocondrial, disponibles para polimerasas y otras enzimas que participan en los procesos de replicación y reparación del mtDNA. Sin embargo, encontramos que el dGTP está significativamente sobrerrepresentado frente al resto de dNTPs en mitocondrias de células humanas y tejidos de ratón. Además, el dGTP aparece mayoritariamente asociado a proteína, concretamente al complejo I de la cadena respiratoria, a través de su subunidad NDUFA10.
La NDUFA10 es una subunidad accesoria del complejo I para la que no se ha descrito una función específica dentro del mismo, pero que resulta esencial para el correcto ensamblaje de la holoenzima. Sin embargo, la NDUFA10 comparte el dominio funcional dNK (dominio dNK, pfam PF01712) con varias de las desoxirribonucleósido quinasas que participan en la ruta de salvamento para la síntesis de dNTPs, como son la TK2, dCK o dGK, con las que también comparte una alta identidad de secuencia. Todas estas enzimas catalizan la fosforilación de los desoxirribonucleósidos usando ATP como donador de fosfato. Sin embargo, no se ha descrito ninguna actividad quinasa asociada a NDUFA10 o al complejo I.
A raíz de estos resultados, generamos distintos modelos experimentales con la finalidad de confirmar la unión del dGTP al complejo I y profundizar en el estudio de dicha interacción. Mediante la introducción de mutaciones dirigidas en la NDUFA10 de líneas celulares humanas hemos localizado el sitio de unión del dGTP dentro del dominio dNK de la proteína. Además hemos determinado que esta unión es altamente específica y estable, y se da en una proporción estequiométrica de 1:1.
Asimismo, hemos obtenido un modelo murino con las mismas mutaciones en el dominio dNK de NDUFA10 que habíamos introducido en células humanas (Ndufa10E160A;R161A/E160A;R161A o NDUFA10KI). A diferencia de lo que ocurre con la proteína humana, las mutaciones introducidas afectan a la estabilidad de la proteína NDUFA10 murina, y con ello al ensamblaje y función del complejo I. Los animales NDUFA10KI desarrollan una cardiomiopatía hipertrófica que causa su muerte entre las semanas 25-30 de vida, probablemente a causa de una alteración grave de la función oxidativa mitocondrial a consecuencia de la desestabilización de NDUFA10 en el corazón. Curiosamente, estas mutaciones parecen tener consecuencias distintas para la estabilidad de la proteína y el complejo I en función del tejido analizado, afectando de forma más leve al cerebro, por ejemplo. En cualquier caso, la disrupción de la interacción NDUFA10-dGTP en los animales NDUFA10KI se traduce en una drástica reducción en el contenido mitocondrial de dGTP en todos los tejidos estudiados, mientras que no se observa ningún efecto sobre el resto de dNTPs, lo que nos permite confirmar in vivo que la interacción con el dGTP se produce a nivel del dominio dNK de la NDUFA10.
Al afectar a una proporción tan importante del dGTP mitocondrial, la interacción descrita con el complejo I a través de su subunidad NDUFA10 podría suponer un nuevo mecanismo de control de la disponibilidad de dNTPs, tratándose de la primera relación directa descrita entre metabolismo oxidativo y la síntesis de DNA.
